牛奶中7種氟喹諾酮類藥物殘留檢測方法

發(fā)布時間:2017-06-02  瀏覽次數(shù):2604

1、安全要求

實(shí)驗(yàn)操作時穿工作服、戴口罩和手套；提取和凈化操作都應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，避免溶劑氣體吸人和皮膚接觸；廢棄的化學(xué)試劑收集到專用容器中集中處理。

2、急救措施

皮膚接觸到有機(jī)溶劑或酸、堿溶液后用清水清洗，有機(jī)溶劑或酸、堿溶液濺入眼中用清水灌洗。

3、適用范圍

該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程適用于牛奶中氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、達(dá)氟沙星、二氟沙星和沙拉沙星單個或混合物殘留量的確證檢測。

4、職責(zé)

進(jìn)行該項(xiàng)檢驗(yàn)的檢驗(yàn)員必須按該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行檢驗(yàn)，質(zhì)量監(jiān)督員負(fù)責(zé)監(jiān)督該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的正確執(zhí)行。

5、檢測原理

試料中殘留的氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、達(dá)氟沙星、二氟沙星和沙拉沙星用含1％甲酸的乙腈溶液提取，HLB固相萃取柱凈后，以高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法測定，外標(biāo)法定量。

6、方法靈敏度

氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、達(dá)氟沙星、二氟沙星或沙拉沙星在牛奶中的檢測限均為5μg/kg，定量限均為10μg/kg。

7、注意事項(xiàng)

凈化時上樣、淋洗、洗脫的流速保持在1～2mL/min。

8、材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求

除特別注明外，以下所用試劑均為分析純；水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。

8.1 喹諾酮類藥物對照品、試劑和藥物儲備液、工作液準(zhǔn)備

8.1.1 氧氟沙星 含氧氟沙星(C18H20FN3O4)不得少于99.0％。

8.1.2 諾氟沙星 含諾氟沙星(C16H18FN3O3)不得少于99.0％。

8.1.3 鹽酸環(huán)丙沙星 含鹽酸環(huán)丙沙星(C17H18FN3O3·HCl)不得少于99.0％。

8.1.4 恩諾沙星 含恩諾沙星(C19H22FN3O3)不得少于99.0％。

8.1.5 甲磺酸達(dá)氟沙星 含甲磺酸達(dá)氟沙星(C19H20FN3O3·CH4O3S)不得少于99.0％。

8.1.6 鹽酸二氟沙星 含鹽酸二氟沙星(C21H19F2N3O3·HCl)不得少于99.0％。

8.1.7 沙拉沙星 含沙拉沙星(C20H17F2N2O3)不得少于99.0％。

8.1.8 甲酸

8.1.9 正丙醇

8.1.10 乙腈色譜純

8.1.11 甲醇色譜純

8.1.12 乙酸銨

8.1.13 乙酸銨溶液(50mmol/L) 取乙酸銨3.85g，加水溶解并稀釋至l000ml，即得。

8.1.14 l％甲酸乙腈溶液 取甲酸1mL，加乙腈稀釋至100mL，即得。

8.1.15 0.1％甲酸甲醇溶液 取甲酸100μl，加甲醇稀釋至100ml，即得。

8.1.16 0.1％甲酸水溶液 取甲酸100μl，加水稀釋至100ml，即得。

8.1.17 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制(1mg/mL) 分別取氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、達(dá)氟沙星、二氟沙星和沙拉沙星7種對照品各約25mg，精密稱定，置同一25mL量瓶中，用0.03mol/L氫氧化鈉溶液溶解并用甲醇稀釋定容至刻度，搖勻即得。置-200C冰箱中保存，有效期為6個月。

8.1.18 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制(1μg/mL) 準(zhǔn)確量取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1mL，置10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻即為10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液；從中準(zhǔn)確量取1.0ml，置10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻即為1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。置-200C冰箱中保存，有效期為3個月。

8.2 儀器和設(shè)備

8.2.1 高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)

8.2.2 天平 感量0.01g

8.2.3 分析天平 感量0.00001g

8.2.4 固相萃取裝置(配真空泵)

8.2.5 樣品濃縮器

8.2.6 渦旋混合器

8.2.7 振蕩器

8.2.8 離心機(jī)

8.2.9 雞心瓶 50mL

8.2.10 離心管 15mL

8.2.1l 固相萃取柱Oasis HLB小柱(60mg/3mL)，或相當(dāng)者。

8.2.12 微孔濾頭 0.45μm

9、檢驗(yàn)步驟

9.1 試料的制備

9.1.1 取新鮮或解凍的供試樣品，作為供試試料。

9.1.2 取新鮮或解凍的空白樣品(2±0.02)g，作為空白試料(陰性對照)。

9.1.3 取新鮮或解凍的空白樣品(2±0.02)g，添加1μg/mL的混合對照溶液0.1mL，作為空白添加試料(陽性對照)。

9.2 提取

9.2.1 取(2±0.02)g試料，置15mL離心管中，加1％甲酸乙腈溶液5mL，渦旋混合提取10s，5000r/min離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清液至50mL雞心瓶。

9.2.2 再用l％甲酸乙腈溶液5mL重復(fù)提取1次，合并上清液。

9.2.3 加正丙醇5mL，于500C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。

9.2.4 殘余物用50mmol/L的乙酸銨溶液4mL溶解，備用。

9.3凈化

9.3.1 固相萃取柱依次用甲醇、50mmol/L乙酸銨溶液各3mL預(yù)洗活化。

9.3.2 取全部備用液過柱，用10％甲醇水溶液3mL淋洗，減壓抽干。

9.3.3 用甲醇3mL洗脫，收集洗脫液，減壓抽干。洗脫液于500C下氮?dú)獯蹈桑贸跏急壤鲃酉?.OmL溶解，渦旋混勻，過濾膜后，供高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

9.4 測定

9.4.1 色譜條件 。

9.4.1.1 色譜柱：XBridge C18150mm×2.1mm(i.d.)，粒徑5μm，或相當(dāng)者。

9.4.1.2 柱溫：300C。

9.4.1.3 進(jìn)樣量：10μL。

9.4.1.4 流動相A：0.1％甲酸甲醇溶液。

流動相B：0.1％甲酸水溶液。

流動相梯度洗脫條件見表1。

9.4.2 質(zhì)譜條件

9.4.2.1 離子源參考參數(shù)見表2。

9.4.2.2 質(zhì)量分析器參考參數(shù)見表3。

9.4.2.3 光電倍增器電壓：650V。

9.4.2.4 定性、定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量見表4。

9.5 檢測數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制

9.5.1 線性考察

準(zhǔn)確量取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用初始比例流動相稀釋成濃度均為5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL的系列混合對照溶液，量取6種濃度的混合對照溶液各1.0ml.，分別用于溶解預(yù)先按提取凈化吹干后的殘余物，渦旋混勻，過濾膜后作為基質(zhì)匹配系列混合對照溶液，從低濃度到高濃度測定，每一濃度進(jìn)樣3針，以峰面積與相應(yīng)對照溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

9.5.2 空白試驗(yàn)和添加試驗(yàn)

空白試料、基質(zhì)匹配陽性添加的提取和凈化采用與樣品相同的方法操作。空白試料、基質(zhì)匹配陽性添加試料得到的特征離子的質(zhì)量色譜圖分別見附錄中圖l和圖2。

9.5.3序列表的編制

試劑空白進(jìn)1針；

樣品空白進(jìn)2針；

對照溶液進(jìn)3針，其RSD<10％；

樣品1-1進(jìn)1針；

樣品1-2進(jìn)1針；

…………

樣品4-1進(jìn)1針；

樣品4-2進(jìn)1針；

陽性添加各進(jìn)1針；

對照溶液進(jìn)2針；

…………

(注：順序的任何調(diào)整應(yīng)有充分理由證明其合理性)

9.5.4 定性需同時滿足下列條件：

9.5.4.1 試劑空白和樣品空白不能出現(xiàn)與陽性對照相同的離子峰。

9.5.4.2 所有離子色譜峰的信噪比(S/N)都在3:1以上，信噪比以峰對峰(PtP)計(jì)算。

9.5.4.3 試樣色譜峰的保留時間，應(yīng)與校正溶液的保留時間一致，容許偏差為±2.5％。

9.5.4.4 試樣溶液中的離子豐度比應(yīng)與校正溶液的一致，容許偏差符合表5的要求。

9.5.5 定量方法

采用基質(zhì)匹配單點(diǎn)校準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)時試樣溶液及對照溶液中7種氟喹諾酮類藥物的峰面積均應(yīng)在儀器檢測線性范圍之內(nèi)。

9.6 記錄與計(jì)算

9.6.1 記錄項(xiàng)目

9.6.1.1 逐項(xiàng)填寫中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所“檢驗(yàn)記錄”首頁。

9.6.1.2 對照品名稱、來源、批號、含量。

9.6.1.3 儲備液、工作液及對照溶液制備及制備日期。

9.6.1.4 試料制備、提取、凈化、測定(包括測定過程中涉及的計(jì)量儀器編號)。

9.6.1.5 原始數(shù)據(jù)(包括儀器測定圖譜和打印的數(shù)據(jù))。

9.6.1.6 計(jì)算公式及計(jì)算過程(軟件計(jì)算除外)。

9.6.2 計(jì)算

按下式計(jì)算試料中7種氟喹諾酮類藥物的殘留量：

式中：

X——試料中氟喹諾酮類藥物的殘留量(μg/kg)；

A——試樣溶液中相應(yīng)氟喹諾酮類藥物的峰面積；

AS——基質(zhì)匹配對照溶液中相應(yīng)氟喹諾酮類藥物的峰面積；

CS——基質(zhì)匹配對照溶液中相應(yīng)氟喹諾酮類藥物的濃度(ng/mL)；

V——濃縮至干后，流動相溶解殘余物所用體積(mL)；

m——供試試料質(zhì)量(g)。

(注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，保留3位有效數(shù)字)

9.6.3 結(jié)果判定

9.6.3.1 線性范圍 在lO～400ng/mL濃度范圍內(nèi)考察線性，計(jì)算回歸方程，其相關(guān)系數(shù)R2>0.990。

9.6.3.2 準(zhǔn)確度 本方法在50～200μg/kg添加濃度的回收率為60％～120％，。

9.6.3.3 精密度 本方法的批內(nèi)變異系數(shù)≤20％，批間變異系數(shù)≤20％。

若方法學(xué)考察符合以上規(guī)定，則供試組織中藥物的殘留量之和 <檢測限時，判定為未檢出；檢測限≤<最高殘留限量時，判定為符合規(guī)定； ≥最高殘留限量時，判定為不符合規(guī)定。

10 附加說明

10.1 本標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證資料制定。

10.2 氟喹諾酮類藥物最高殘留限量：