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雞肉和豬肉中四環(huán)素類藥物殘留檢測方法――高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法(一)
發(fā)布時間：2017-09-01
1、安全要求
實驗操作時穿工作服、戴口罩和手套；提取和凈化操作都應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，避免溶劑氣體吸人和皮膚接觸；廢棄的化學(xué)試劑收集到專用容器中集中處理。
2、急救措施
皮膚接觸到有機溶劑或酸、堿溶液后用清水清洗，有機溶劑或酸、堿溶液濺人眼中用清水灌洗。
3、適用范圍
該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程適用于雞肉和豬肉組織中四環(huán)素、土霉素及金霉素單個或混合物殘留量的確證檢測。
4、職責(zé)
進(jìn)行該項檢驗的檢驗員必須按該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行檢驗，質(zhì)量監(jiān)督員負(fù)責(zé)監(jiān)督該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的正確執(zhí)行。
5、檢測原理
試料中殘留的四環(huán)素、土霉素及金霉素經(jīng)緩沖液提取，HLB柱凈化。用高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法測定，外標(biāo)法定量。
6、方法靈敏度
四環(huán)素、土霉素和金霉素在雞肉和豬肉組織中的檢測限為5μg/kg，定量限為10μg/kg。
7、注意事項
除特別說明外，淋洗和洗脫過程中應(yīng)避免萃取柱柱床干涸。
8、材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求
除特別注明外，以下所用試劑均為分析純；水為符合GB/T6682規(guī)定的一級水。
8、1 對照品、試劑和藥物儲備液、工作液準(zhǔn)備
8、1.1 鹽酸土霉素 含鹽酸土霉素(C22H25C1N209) 不得少于96％。
8、1.2 鹽酸四環(huán)素 含鹽酸四環(huán)素(C22H24C12N208) 不得少于97％。
8、1.3 鹽酸金霉素含鹽酸金霉素(C22H24C12N2O8) 不得少于83％。
8、1.4 檸檬酸(C6H8O7?H2O)
8、1.5 磷酸氫二鈉(Na2HPO4?12H2O)
8、1.6 乙二胺四乙酸二鈉(C10H14N2Na2O8?2H2O)
8、1.7 氫氧化鈉
8、1.8 甲醇色譜純
8、1.9 甲酸
8、1.10 乙腈色譜純
8、1.11 1mol/L氫氧化鈉溶液 取氫氧化鈉4g，加水溶解并稀釋至100mL，即得。
8、1.12 Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液的配制 分別取檸檬酸12.9g，磷酸氫二鈉10.9g，乙二胺四乙酸二鈉37.2g，加水900mL溶解，用lmo/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至3.8，加水稀釋至1000mL，即得。
8、1.13標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制(1mg/mL) 準(zhǔn)確稱取約11.16mg鹽酸四環(huán)素、10.95mg鹽酸土霉素和10.87mg鹽酸金霉素對照品，精密稱定，分別置于同一10mL容量瓶內(nèi)，用甲醇溶解并稀釋成濃度均為lmg/mL的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。置-20℃冰箱中保存，有效期為1個月。
8、1.14標(biāo)準(zhǔn)工作液配制(1μg/mL) 精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1mL，置于一lOmL容量瓶中，用甲醇一水溶液(3+7，v/v)稀釋成濃度為10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；從中準(zhǔn)確量取1.OmL，置于一10mL容量瓶中，用甲醇一水溶液(3+7，v/v)稀釋成濃度為1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。置一200C冰箱中保存，有效期為1個月。
8、2 儀器和設(shè)備
8、2.1 高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)
8、2.2 組織勻漿機
8、2.3 分析天平感量0.000 01g
8、2.4 天平感量0.01g
8、2.5 渦旋混合器
8、2.6 水平振蕩器
8、2.7 高速離心機
8、2.8 酸度計
8、2.9 離心管50mL
8、2.10固相萃取柱HLB小柱(60mg/3mL)
8、2.11 樣品濃縮器
8、2.12 微孔濾膜孔徑0.45μm
9 檢驗步驟
9、1 試料的制備
9、1.1 取勻漿后的供試樣品，作為供試試料。
9、1.2 取勻漿后的空白樣品(2±0.02)
9、1.3 取勻漿后的空白樣品(2±0.02)
添加試料(陽性對照)。
9、2 提取
9、2.1 取10000r/min勻漿1min的試料1和試料2各(2±0.02)g，置于50mL離心管中，加Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液8mL，渦旋混勻，8000r/min離心10min，傾出上清液另一離心管內(nèi)。
9、2.2 再用Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液8mL重復(fù)提取一次，合并上清液，作為備用液。
9、3凈化
9、3.1 固相萃取柱依次用甲醇5mL、水5mL預(yù)洗活化。
9、3.2 取備用液8mL過柱，用水5mL、5％甲醇水5mL淋洗，減壓抽干。
9、3.3 用甲醇5mL洗脫，減壓抽干，氮氣吹干洗脫液(水浴溫度低于40％)。用甲醇一
水(3+7，v/v)1.0mL溶解殘余物，渦旋混勻，過濾膜后供高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。
9、4測定
9、4.1色譜條件
9、4.1.1 色譜柱：XBridge C18150mm×2.1mm(i．d．)，粒徑5μm，或相當(dāng)者。
9、4.1.2 柱溫：20℃。
9、4.1.3 進(jìn)樣量：20μL。
9、4.1.4 流動相A：0.3％甲酸乙腈溶液。
流動相B：0.3％甲酸水溶液。
流動相梯度見表1。
9、4.2 質(zhì)譜條件
9、4.2.1 離子源參考參數(shù)見表2。
9、4.2.3 光電倍增器電壓：650V。
9、4.2.4 四環(huán)素類藥物的定性、定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量見表4。
參考資料：獸藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程
