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分析參數(shù)設(shè)置
發(fā)布時(shí)間：2017-09-01
自動(dòng)生化分析儀的參數(shù)就是儀器工作的指令，參數(shù)的正確設(shè)置和合理使用是儀器正常工作的前提條件，操作者通過設(shè)置正確的參數(shù)控制儀器完成一系列復(fù)雜而有序的操作程序。
指揮儀器工作的參數(shù)有很多，有些參數(shù)在生產(chǎn)制造中已設(shè)置好，如機(jī)械操作、計(jì)算機(jī)軟件等，只需選擇即可進(jìn)行工作。自動(dòng)生化分析儀操作者需進(jìn)行設(shè)置的參數(shù)包括波長、溫度、樣品量和試劑量、測定方法、校正方法、反應(yīng)時(shí)間和控制因素等。
(一)波長的選擇
測定波長的選擇有3個(gè)主要條件：①待測物質(zhì)在該波長下的光吸收最大；②其吸收峰宜較寬而鈍，而不是處于尖峰或陡肩，一般不選光譜中的末端吸收峰，換句話說，該吸收峰處的吸光度隨波長變化較小；③常見干擾物在該波長下的光吸收最小。試劑盒說明一般已提供波長參數(shù)。實(shí)際波長選擇需要了解待測物質(zhì)和干擾組分對(duì)不同波長單色光的吸收程度，即以波長為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)作吸收光譜曲線(光吸收曲線)。
1．單波長 單波長是用一個(gè)波長檢測物質(zhì)的光吸收強(qiáng)度的方法。當(dāng)測定體系中只含有一種組分或混合溶液中待測組分的吸收峰與其他共存物質(zhì)的吸收峰無重疊時(shí)，可選用該方法。如果一個(gè)物質(zhì)有幾個(gè)吸收峰，可選擇吸光度最大的一個(gè)波長，或者選擇在吸收峰處吸光度隨波長變化較小的某個(gè)波長。
2．雙波長或多波長 用2個(gè)或多個(gè)不同波長檢測。當(dāng)被檢溶液混濁或存在較大干擾物質(zhì)的光吸收時(shí)會(huì)出現(xiàn)光散射和非特異性光吸收，從而影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，此時(shí)可用2個(gè)或多個(gè)不同波長測定。雙波長的應(yīng)用是為了消除樣品中對(duì)測定有干擾的物質(zhì)的影響，而實(shí)際應(yīng)用中選擇輔助波長主要用于消除脂血、溶血、黃疸的干擾。脂血樣品中的脂質(zhì)吸收光譜在300～600nm均有吸收，呈逐漸下降的趨勢(shì)；溶血樣品中的血紅蛋白在350nm、400nm、540nm、580nm有4個(gè)吸收峰；黃疸樣品中的膽紅素在300～500nm均有吸收，在400～500nm之問有強(qiáng)吸收峰。由于脂血、溶血、黃疸樣品在較寬的波長范圍內(nèi)有較強(qiáng)的吸收光譜存在，因而常常同測定波長有重疊，此時(shí)測得的吸光度包含待測物質(zhì)的吸光度和干擾物質(zhì)的吸光度，選用輔助波長可消除干擾物質(zhì)的吸光度。根據(jù)光吸收曲線選擇最大吸收峰作為主波長，副波長的選擇原則是干擾物在主波長的吸光度與副波長的吸光度越接近越好，測定時(shí)主波長的吸光度減去副波長的吸光度可消除溶血、濁度等干擾物的影響，如己糖激酶法測定血糖主波長340nm，副波長可選380nm，因?yàn)檠t蛋白在這兩個(gè)波長的吸光度相同，對(duì)消除溶血和濁度的影響比較有效，提高了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)還需注意副波長不能設(shè)在有色物吸收的靈敏區(qū)域，否則會(huì)降低測定的靈敏度。
(二)溫度的選擇
自動(dòng)生化分析儀通常設(shè)有25℃、30℃、37℃三種溫度，為了使酶反應(yīng)的溫度與體內(nèi)溫度一致，一般固定為37℃。此項(xiàng)一般在系統(tǒng)參數(shù)中設(shè)置。
(三)樣品量與試劑量
各種分析儀的最小反應(yīng)液總體積為80～500μl不等，樣品量和試劑量的設(shè)置主要由樣品體積分?jǐn)?shù)(sample volume fraction，SVF)來決定。SVF是樣品體積(Vs)與反應(yīng)總體積(Vt)的比值，即SVF=Vs/Vt。Vt包括了反應(yīng)體系中所用的樣品體積、樣品稀釋液體積、試劑(單、雙試劑或多試劑)體積、試劑稀釋液體積之和。
樣品量與試劑量一般可按照試劑說明書上的比例，并結(jié)合儀器的特性，如樣品和試劑最小加樣量及加樣量范圍、最小反應(yīng)體積等進(jìn)行設(shè)置。SVF越大，線性范圍越窄，但靈敏度越高；隨意改變SVF不盡可靠，尤其是測定酶活性時(shí)，將酶樣品稀釋，SVF減少，酶的變性失活、酶的抑制或激活、酶的聚合或解離等隨之發(fā)生改變，酶活性并不與SVF成正比。如果根據(jù)手工法按比例縮減或重新設(shè)計(jì)，仍需考慮儀器的檢測靈敏度、線性范圍及樣品中其他成分的影響。
(四)試劑的選擇
I．單試劑法反應(yīng)體系中只加一種試劑的方法稱為單試劑法。常見的有：①單試劑單波長法：指在選定的溫度和特定波長的情況下，讀取反應(yīng)一定時(shí)間時(shí)的吸光度，在單試劑法中最常見。反應(yīng)時(shí)間應(yīng)該根據(jù)反應(yīng)特性和特定儀器而定，以不超過儀器的一個(gè)分析周期為佳；反應(yīng)溫度常選擇37℃。②單試劑雙波長法：該法的主要目的是為了消除檢測體系或樣品的混濁，常用于終點(diǎn)分析。③樣品空白法：該法使用單波長或雙波長均可，當(dāng)使用雙波長法仍不能糾正混濁、色素、脂血等影響時(shí)，常用本法。
2．雙試劑法在反應(yīng)過程中試劑分開配制和加入反應(yīng)系統(tǒng)，可以消除一些干擾和非特異性反應(yīng)，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。常見的有：①雙試劑單波長一點(diǎn)法：檢測試劑分成兩部分加入，只讀一次吸光度，不宜采用單試劑時(shí)可用此法。②雙試劑兩點(diǎn)法：在加入第一試劑后讀取吸光度(此時(shí)試劑與標(biāo)本不發(fā)生反應(yīng)，吸光度為標(biāo)本或試劑所產(chǎn)生)，再加第二試劑，反應(yīng)一定時(shí)間后再讀取吸光度，以兩次吸光度之差計(jì)算結(jié)果。此法不但可以避免試劑不穩(wěn)定造成的影響，還可以消除標(biāo)本帶來的某些影響，使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。目前較多的全自動(dòng)生化分析儀的終點(diǎn)分析均可用此法。③雙試劑雙波長法：目前有的儀器用雙波長，有的可自行設(shè)置。因?yàn)椴煌膬x器具有不同的功能，實(shí)際工作中應(yīng)根據(jù)需要而定。
(五)測定方法的選擇
本節(jié)中已介紹了幾種常用的分析方法，半自動(dòng)生化分析儀一般具備其中的一點(diǎn)終點(diǎn)、兩點(diǎn)終點(diǎn)(單試劑)、連續(xù)監(jiān)測法(只能是一種固定方法)。全自動(dòng)生化分析儀的功能比較全面，具備前述的各種方法，可以根據(jù)儀器的分析項(xiàng)目及需要設(shè)置，選擇相應(yīng)的分析方法。
(六)分析時(shí)間的選擇
分析時(shí)間的選擇和設(shè)定是自動(dòng)生化分析儀參數(shù)設(shè)定的重要環(huán)節(jié)，直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。生化反應(yīng)的時(shí)間是某一項(xiàng)目所特有的，根據(jù)所采用的測定方法不同而異。對(duì)于終點(diǎn)分析，測定時(shí)間的選擇應(yīng)充分考慮到干擾的問題。一點(diǎn)終點(diǎn)法的分析時(shí)間應(yīng)設(shè)在待測物質(zhì)反應(yīng)將完成時(shí)，過早會(huì)由于反應(yīng)未達(dá)到終點(diǎn)而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，過遲易受其他反應(yīng)物質(zhì)干擾。例如，應(yīng)用一點(diǎn)終點(diǎn)分析法的溴甲酚綠法測定白蛋白時(shí)，白蛋白Iq溴甲酚綠反應(yīng)快，在1分鐘內(nèi)基本上反應(yīng)完全，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，α-球蛋白同溴甲酚綠反應(yīng)形成干擾，因而溴甲酚綠法測定白蛋白，其測定時(shí)間應(yīng)定于1分鐘。兩點(diǎn)終點(diǎn)法應(yīng)選擇合適的第一試劑和第二試劑加入時(shí)間，以消除標(biāo)本空白和內(nèi)源性物質(zhì)干擾。連續(xù)監(jiān)測法一般用于酶活力的測定，而酶活力的大小是用反應(yīng)速度來表示，因而要求在零級(jí)反應(yīng)期內(nèi)測定反應(yīng)速率，此時(shí)的反應(yīng)速率不受底物濃度的影響，僅同酶活力大小有關(guān)。對(duì)于一種物質(zhì)的測定，由于選擇試劑和分析方法不同，其測定時(shí)問也隨之變化，因而對(duì)于特定的試劑和分析方法，應(yīng)先仔細(xì)觀察時(shí)問．反應(yīng)進(jìn)程曲線，從曲線上選擇最佳的測定時(shí)間。
(七)線性范圍的選擇
當(dāng)反應(yīng)吸光度處于線性范圍內(nèi)時(shí)，檢測結(jié)果與吸光度變化成正比，準(zhǔn)確反映待測物的濃度。如果吸光度設(shè)置過小，則非線性機(jī)會(huì)出現(xiàn)會(huì)增多，或觀察時(shí)間延長，工作效率降低；如吸光度設(shè)置過大，則失去了判斷線性的意義。線性范圍應(yīng)選擇數(shù)據(jù)收集窗時(shí)間內(nèi)吸光度變化的允許范圍，對(duì)于全自動(dòng)生化分析儀而言，主要是設(shè)定吸光度的最大值和最小值。
(八)校正方法
自動(dòng)生化分析儀內(nèi)設(shè)置的校正方法一般包括一點(diǎn)校正、二點(diǎn)校正、多點(diǎn)校正、線性校正、非線性(對(duì)數(shù)、指數(shù)法、量程法)校正等。一點(diǎn)法校正曲線為通過坐標(biāo)零點(diǎn)和校準(zhǔn)點(diǎn)的一條直線，常用于酶類項(xiàng)目測定，例如ALT、AST、LDH等；二點(diǎn)校正法是指用一個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和一個(gè)空白試劑進(jìn)行校正的方法，二點(diǎn)法校正曲線是通過設(shè)定的兩個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)，但不通過坐標(biāo)零點(diǎn)的一條直線，該法要求反應(yīng)必須符合Lamber-Beer。定律，例如TP、ALB、TG等，可用于終點(diǎn)法及連續(xù)監(jiān)測法的校正；多點(diǎn)校正法是多個(gè)具有濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品用非線性法進(jìn)行校正，多點(diǎn)法的校正曲線不是一條直線，而可能是對(duì)數(shù)曲線、雙曲線或不規(guī)則曲線，多用于免疫濁度法等工作曲線呈各種曲線形式的校正，例如CRP、ApoA I、Lp(a)等。線性曲線的濃度與吸光度呈線性。非線性校正包括各種對(duì)數(shù)和指數(shù)校正及量程法校正。量程法是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線上每兩點(diǎn)問濃度與吸光度的關(guān)系計(jì)算待測物的濃度。非線性曲線包括對(duì)數(shù)曲線、指數(shù)曲線、二次方程曲線、三次方程曲線、Logit轉(zhuǎn)換和．logistic函數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線呈對(duì)數(shù)或指數(shù)曲線特征的項(xiàng)目選擇所對(duì)應(yīng)的方法校正；二次方程曲線呈拋物線，校準(zhǔn)點(diǎn)需大于4點(diǎn)；三次方程曲線呈雙拋物線或多峰形，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室中的曲線常有一凸一凹的拐點(diǎn)，類似S形，校準(zhǔn)點(diǎn)需大于5，是免疫比濁法常用曲線；Logit轉(zhuǎn)換和logistic函數(shù)校準(zhǔn)點(diǎn)數(shù)目應(yīng)比參數(shù)的數(shù)目多2。
參考資料：分析化學(xué)
