分析參數設置
發布時間：2017-09-01
自動生化分析儀的參數就是儀器工作的指令，參數的正確設置和合理使用是儀器正常工作的前提條件，操作者通過設置正確的參數控制儀器完成一系列復雜而有序的操作程序。
指揮儀器工作的參數有很多，有些參數在生產制造中已設置好，如機械操作、計算機軟件等，只需選擇即可進行工作。自動生化分析儀操作者需進行設置的參數包括波長、溫度、樣品量和試劑量、測定方法、校正方法、反應時間和控制因素等。
(一)波長的選擇
測定波長的選擇有3個主要條件：①待測物質在該波長下的光吸收最大；②其吸收峰宜較寬而鈍，而不是處于尖峰或陡肩，一般不選光譜中的末端吸收峰，換句話說，該吸收峰處的吸光度隨波長變化較小；③常見干擾物在該波長下的光吸收最小。試劑盒說明一般已提供波長參數。實際波長選擇需要了解待測物質和干擾組分對不同波長單色光的吸收程度，即以波長為橫坐標、吸光度為縱坐標作吸收光譜曲線(光吸收曲線)。
1．單波長 單波長是用一個波長檢測物質的光吸收強度的方法。當測定體系中只含有一種組分或混合溶液中待測組分的吸收峰與其他共存物質的吸收峰無重疊時，可選用該方法。如果一個物質有幾個吸收峰，可選擇吸光度最大的一個波長，或者選擇在吸收峰處吸光度隨波長變化較小的某個波長。
2．雙波長或多波長 用2個或多個不同波長檢測。當被檢溶液混濁或存在較大干擾物質的光吸收時會出現光散射和非特異性光吸收，從而影響測定結果的準確性，此時可用2個或多個不同波長測定。雙波長的應用是為了消除樣品中對測定有干擾的物質的影響，而實際應用中選擇輔助波長主要用于消除脂血、溶血、黃疸的干擾。脂血樣品中的脂質吸收光譜在300～600nm均有吸收，呈逐漸下降的趨勢；溶血樣品中的血紅蛋白在350nm、400nm、540nm、580nm有4個吸收峰；黃疸樣品中的膽紅素在300～500nm均有吸收，在400～500nm之問有強吸收峰。由于脂血、溶血、黃疸樣品在較寬的波長范圍內有較強的吸收光譜存在，因而常常同測定波長有重疊，此時測得的吸光度包含待測物質的吸光度和干擾物質的吸光度，選用輔助波長可消除干擾物質的吸光度。根據光吸收曲線選擇最大吸收峰作為主波長，副波長的選擇原則是干擾物在主波長的吸光度與副波長的吸光度越接近越好，測定時主波長的吸光度減去副波長的吸光度可消除溶血、濁度等干擾物的影響，如己糖激酶法測定血糖主波長340nm，副波長可選380nm，因為血紅蛋白在這兩個波長的吸光度相同，對消除溶血和濁度的影響比較有效，提高了測定結果的準確性。同時還需注意副波長不能設在有色物吸收的靈敏區域，否則會降低測定的靈敏度。
(二)溫度的選擇
自動生化分析儀通常設有25℃、30℃、37℃三種溫度，為了使酶反應的溫度與體內溫度一致，一般固定為37℃。此項一般在系統參數中設置。
(三)樣品量與試劑量
各種分析儀的最小反應液總體積為80～500μl不等，樣品量和試劑量的設置主要由樣品體積分數(sample volume fraction，SVF)來決定。SVF是樣品體積(Vs)與反應總體積(Vt)的比值，即SVF=Vs/Vt。Vt包括了反應體系中所用的樣品體積、樣品稀釋液體積、試劑(單、雙試劑或多試劑)體積、試劑稀釋液體積之和。
樣品量與試劑量一般可按照試劑說明書上的比例，并結合儀器的特性，如樣品和試劑最小加樣量及加樣量范圍、最小反應體積等進行設置。SVF越大，線性范圍越窄，但靈敏度越高；隨意改變SVF不盡可靠，尤其是測定酶活性時，將酶樣品稀釋，SVF減少，酶的變性失活、酶的抑制或激活、酶的聚合或解離等隨之發生改變，酶活性并不與SVF成正比。如果根據手工法按比例縮減或重新設計，仍需考慮儀器的檢測靈敏度、線性范圍及樣品中其他成分的影響。
(四)試劑的選擇
I．單試劑法反應體系中只加一種試劑的方法稱為單試劑法。常見的有：①單試劑單波長法：指在選定的溫度和特定波長的情況下，讀取反應一定時間時的吸光度，在單試劑法中最常見。反應時間應該根據反應特性和特定儀器而定，以不超過儀器的一個分析周期為佳；反應溫度常選擇37℃。②單試劑雙波長法：該法的主要目的是為了消除檢測體系或樣品的混濁，常用于終點分析。③樣品空白法：該法使用單波長或雙波長均可，當使用雙波長法仍不能糾正混濁、色素、脂血等影響時，常用本法。
2．雙試劑法在反應過程中試劑分開配制和加入反應系統，可以消除一些干擾和非特異性反應，確保檢測結果的準確性。常見的有：①雙試劑單波長一點法：檢測試劑分成兩部分加入，只讀一次吸光度，不宜采用單試劑時可用此法。②雙試劑兩點法：在加入第一試劑后讀取吸光度(此時試劑與標本不發生反應，吸光度為標本或試劑所產生)，再加第二試劑，反應一定時間后再讀取吸光度，以兩次吸光度之差計算結果。此法不但可以避免試劑不穩定造成的影響，還可以消除標本帶來的某些影響，使檢測結果更準確。目前較多的全自動生化分析儀的終點分析均可用此法。③雙試劑雙波長法：目前有的儀器用雙波長，有的可自行設置。因為不同的儀器具有不同的功能，實際工作中應根據需要而定。
(五)測定方法的選擇
本節中已介紹了幾種常用的分析方法，半自動生化分析儀一般具備其中的一點終點、兩點終點(單試劑)、連續監測法(只能是一種固定方法)。全自動生化分析儀的功能比較全面，具備前述的各種方法，可以根據儀器的分析項目及需要設置，選擇相應的分析方法。
(六)分析時間的選擇
分析時間的選擇和設定是自動生化分析儀參數設定的重要環節，直接影響檢測結果的準確性。生化反應的時間是某一項目所特有的，根據所采用的測定方法不同而異。對于終點分析，測定時間的選擇應充分考慮到干擾的問題。一點終點法的分析時間應設在待測物質反應將完成時，過早會由于反應未達到終點而影響結果的準確性，過遲易受其他反應物質干擾。例如，應用一點終點分析法的溴甲酚綠法測定白蛋白時，白蛋白Iq溴甲酚綠反應快，在1分鐘內基本上反應完全，隨著反應時間的延長，α-球蛋白同溴甲酚綠反應形成干擾，因而溴甲酚綠法測定白蛋白，其測定時間應定于1分鐘。兩點終點法應選擇合適的第一試劑和第二試劑加入時間，以消除標本空白和內源性物質干擾。連續監測法一般用于酶活力的測定，而酶活力的大小是用反應速度來表示，因而要求在零級反應期內測定反應速率，此時的反應速率不受底物濃度的影響，僅同酶活力大小有關。對于一種物質的測定，由于選擇試劑和分析方法不同，其測定時問也隨之變化，因而對于特定的試劑和分析方法，應先仔細觀察時問．反應進程曲線，從曲線上選擇最佳的測定時間。
(七)線性范圍的選擇
當反應吸光度處于線性范圍內時，檢測結果與吸光度變化成正比，準確反映待測物的濃度。如果吸光度設置過小，則非線性機會出現會增多，或觀察時間延長，工作效率降低；如吸光度設置過大，則失去了判斷線性的意義。線性范圍應選擇數據收集窗時間內吸光度變化的允許范圍，對于全自動生化分析儀而言，主要是設定吸光度的最大值和最小值。
(八)校正方法
自動生化分析儀內設置的校正方法一般包括一點校正、二點校正、多點校正、線性校正、非線性(對數、指數法、量程法)校正等。一點法校正曲線為通過坐標零點和校準點的一條直線，常用于酶類項目測定，例如ALT、AST、LDH等；二點校正法是指用一個濃度的標準品和一個空白試劑進行校正的方法，二點法校正曲線是通過設定的兩個校準點，但不通過坐標零點的一條直線，該法要求反應必須符合Lamber-Beer。定律，例如TP、ALB、TG等，可用于終點法及連續監測法的校正；多點校正法是多個具有濃度梯度的標準品用非線性法進行校正，多點法的校正曲線不是一條直線，而可能是對數曲線、雙曲線或不規則曲線，多用于免疫濁度法等工作曲線呈各種曲線形式的校正，例如CRP、ApoA I、Lp(a)等。線性曲線的濃度與吸光度呈線性。非線性校正包括各種對數和指數校正及量程法校正。量程法是根據標準曲線上每兩點問濃度與吸光度的關系計算待測物的濃度。非線性曲線包括對數曲線、指數曲線、二次方程曲線、三次方程曲線、Logit轉換和．logistic函數。標準曲線呈對數或指數曲線特征的項目選擇所對應的方法校正；二次方程曲線呈拋物線，校準點需大于4點；三次方程曲線呈雙拋物線或多峰形，醫學實驗室中的曲線常有一凸一凹的拐點，類似S形，校準點需大于5，是免疫比濁法常用曲線；Logit轉換和logistic函數校準點數目應比參數的數目多2。
參考資料：分析化學
