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液相色譜分離法
發(fā)布時(shí)間：2017-09-01
色譜法又稱層析法或色層分析法，是一種物理化學(xué)分離方法。其分離原理是混合物中各組分在兩相之間溶解能力、吸附能力或其他親和作用的差別，使其在兩相中分配系數(shù)不同，當(dāng)兩相做相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，組分在兩相間進(jìn)行連續(xù)多次分配，使得備組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定順序由固定相中流出，實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離。其中的一相固定不動(dòng)，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過(guò)此固定相的流體(氣體或液體)，稱為流動(dòng)相。
兩相及兩相的相對(duì)運(yùn)動(dòng)構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)，色譜分析過(guò)程中總是由一種流動(dòng)相帶著被分離的物質(zhì)流經(jīng)固定相，從而使試樣中的各種組分分離。按照流動(dòng)相聚集態(tài)不同，色譜法可分為氣相色譜和液相色譜；按固定相的形狀和操作方式，可分為紙色譜、薄層色譜和柱色譜；按照被分離物質(zhì)在固定相中的作用原理不同，又可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠色譜。本節(jié)主要介紹紙色譜法和薄層色譜法。
一、紙色譜
1、分離原理
紙色譜法是以色譜用濾紙為載體的液相色譜法。分離原理一般認(rèn)為是分配色譜。濾紙被看作是一種惰性載體，濾紙纖維素中吸附著的水為固定相，流動(dòng)相又叫展開劑，既可用與水不相混溶的溶劑，也可用丙醇、乙醇、丙酮等與水混溶的溶劑，因?yàn)闉V紙纖維素中所吸附20％～26％的水分中有6％左右通過(guò)氫鍵與纖維素上的羧基結(jié)合成復(fù)合物，故這部分水與和水相混溶的溶劑仍能形成類似不相混溶的兩相。
將試樣點(diǎn)在濾紙的一端，并將該端浸在展開劑中(圖9―3)，由于毛細(xì)作用，流動(dòng)相自下而上不斷上升，經(jīng)過(guò)試樣點(diǎn)時(shí)，帶動(dòng)試樣向上運(yùn)動(dòng)，被分離的各組分將在固定相(水相)和流動(dòng)相(有機(jī)相)之間不斷進(jìn)行分配和再分配，分配比大的組分上升得快(圖9―4，B組分)，分配比小的組分上升得慢(圖9―4，A組分)，從而不同組分將會(huì)得到分離。如果這些組分顯色，將會(huì)在濾紙上顯現(xiàn)出若干個(gè)分開的色斑。
比移值在紙色譜分離法中，通常用比移值(Rf)來(lái)衡量各組分分離情況。Rf的定義為：組分的遷移距離與展開劑的遷移距離之比稱為比移值(圖9―4)。
由于組分被保留在濾紙上，它的移動(dòng)距離總是小于展開劑的移動(dòng)距離，因此，Rf總是小于1；如果Rf=0，則該組分不溶于展開劑，留在原點(diǎn)不動(dòng)，分配比?。籖f=1，該組分不溶于固定相(水)，不被固定相保留，隨溶劑前沿一起移動(dòng)，分配比大。
比移值是紙色譜的基本定性參數(shù)，它說(shuō)明組分在色譜系統(tǒng)中的保留行為。Rf大小與組分性質(zhì)、流動(dòng)相及溶解度有關(guān)。極性組分易保留在固定相中，其Rf小，且隨流動(dòng)相極性增強(qiáng)，Rf增大；非極性組分易流出，其Rf大，且隨流動(dòng)相極性增強(qiáng)，Rf減小。由于影響Rf的因素很多，要想得到重復(fù)的Rf，就必須嚴(yán)格控制色譜條件的一致性。
根據(jù)比移值的差別的大小還可以進(jìn)行分離可能性的判斷，兩組分的Rf值差別越大，分離效果越好，一般認(rèn)為兩組分的△Rf＞0.02，兩組分即可得到完全分離。
2、操作方法
(1)濾紙的選擇要求
用于色譜分離的濾紙必須具備下述條件：①質(zhì)地和厚薄必須均勻，邊緣整齊，平整無(wú)折痕，無(wú)污漬，不與試樣組分和吸附劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；②紙纖維疏松度適當(dāng)，過(guò)于疏松易使斑點(diǎn)擴(kuò)散，過(guò)于緊密則流速太慢；③有一定的強(qiáng)度，不易斷裂；④純度高，不含填充劑，灰分在O.01％以下，否則金屬離子雜質(zhì)會(huì)與某些組分結(jié)合，影響分離效果。
(2)點(diǎn)樣
溶解樣品的溶劑、點(diǎn)樣量和正確的點(diǎn)樣方法對(duì)獲得好的分離非常重要。溶解樣品的溶劑最好用與展開劑極性類似的溶劑，盡量使點(diǎn)樣后溶劑能迅速揮發(fā)，以減小色斑的擴(kuò)散。適當(dāng)?shù)狞c(diǎn)樣量，可使斑點(diǎn)集中，點(diǎn)樣量過(guò)大，易拖尾或擴(kuò)散，點(diǎn)樣量過(guò)少，不易檢出。點(diǎn)樣時(shí)可用管口平整的玻璃毛細(xì)管或微量注射器，一張濾紙條可并排點(diǎn)上數(shù)點(diǎn)試液，兩點(diǎn)試液間應(yīng)相距一定距離，原點(diǎn)愈小愈好，一般直徑以2～3mm為宜。
(3)展開劑的選擇
展開劑的選擇主要根據(jù)被分離物質(zhì)的極性。一般先選擇單一溶劑，但對(duì)難分離組分，則需使用二元或三元溶劑(有機(jī)溶劑、酸和水)，通過(guò)比例調(diào)節(jié)展開劑的極性，改善分離效果。
展開劑各組分間以及它們與分離的物質(zhì)問(wèn)都不應(yīng)發(fā)生反應(yīng)；選擇的展開劑應(yīng)使待測(cè)組分在兩相間迅速達(dá)到分配平衡。
(4)展開方法
一般用普通的豎式展開槽采用上行法展開，用培養(yǎng)皿可作徑向展開，還可采用下行展開法和二向展開法等。展開時(shí)，應(yīng)將展開槽密封，防止溶劑揮發(fā)。
(5)顯色
對(duì)于有色物質(zhì)，展開后即可直接觀察到各個(gè)色斑。對(duì)于無(wú)色物質(zhì)，應(yīng)用各種物理的和化學(xué)的方法使之顯色。由于很多有機(jī)化合物在紫外照射下，顯現(xiàn)其特有的熒光，故可在紫外光照射下，用鉛筆畫出熒光斑點(diǎn)，或用化學(xué)顯色法噴以適當(dāng)?shù)娘@色劑如茚三酮正丁醇溶液、Fecl3水溶液等，也可以用碘蒸氣熏。注意的是，顯色之后應(yīng)立即用鉛筆畫出各色斑點(diǎn)的位置，以免褪色或變色后不易尋找。
3、應(yīng)用
紙色譜法試樣用量少，操作簡(jiǎn)便，分離效果好，常應(yīng)用于有機(jī)物的分離。例如：葡萄糖、麥芽糖和木糖混合糖類的分離，可采用正丁醇：冰醋酸：水=4∶1∶5(體積比)為展開劑，用硝酸銀氨溶液噴灑，即出現(xiàn)Ag的褐色斑點(diǎn)。其中，葡萄糖的Rf為0.16，麥芽糖的Rf為O．1l，木糖的Rf是0.28，由Rf值可判斷是哪種糖。又如甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸混合氨基酸的分離，采用的展開劑為：正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶2(體積比)，用茚三酮顯色。
4、薄層色譜分離法特點(diǎn)
薄層色譜分離法是將固定相吸附劑均勻地涂在玻璃上制成薄層板，試樣中的各組分在固定相和作為展開劑的流動(dòng)相之間不斷地發(fā)生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配過(guò)程。不同物質(zhì)上升的距離不一樣而形成相互分開的斑點(diǎn)從而達(dá)到分離。
相對(duì)于紙色譜，薄層色譜具有以下特點(diǎn)：①快速，展開的時(shí)間短。一般紙色譜需要幾小時(shí)至幾十小時(shí)，薄層色譜一般只需十幾分鐘或幾十分鐘。②使用無(wú)機(jī)吸附劑如硅膠做固定相，可以采用腐蝕性的顯色劑，如濃硫酸、濃鹽酸和濃磷酸。對(duì)于特別難以檢出的化合物，可噴以濃硫酸，然后小心加熱，使有機(jī)物碳化，顯棕色斑點(diǎn)，而紙色譜則無(wú)法檢出。③廣泛地選用各種固定相，比紙上色譜有顯著的靈活性。④紙色譜法斑點(diǎn)的擴(kuò)散作用嚴(yán)重，降低了單位面積中樣品的濃度，降低檢出靈敏度。薄層色譜法擴(kuò)散作用較少，斑點(diǎn)比較密集，檢測(cè)靈敏度較高。⑤薄層色譜法適于分析小量樣品(一般幾微克到幾十微克)，也適于大量樣品的分離(可以分離出幾毫克甚至幾十毫克組分)。
5、固定相和展開劑的選擇
薄層色譜中，固定相的選擇十分重要。常用的固定相吸附劑如下：
(1)硅膠
薄層用的硅膠粒度為10～40μm。不含黏合劑的硅膠稱硅膠H，硅膠中加入10％～15％煅石膏作黏合劑稱硅膠G。若在硅膠G中加入熒光物質(zhì)稱硅膠GF254或硅膠GF254+364，表示在254nm或365nm紫外光下呈強(qiáng)烈黃綠色背景，適用于本身不發(fā)光又無(wú)適當(dāng)顯色劑顯色的物質(zhì)；最常用的是硅膠GF254。硅膠是一種微酸性極性固定相，適用于酸性、中性物質(zhì)分離；在展開劑中加入少量酸或堿，可改變硅膠的酸堿性質(zhì)，適合各種物質(zhì)的分離。
(2)氧化鋁
氧化鋁與硅膠類似，有氧化鋁H、氧化鋁G、氧化鋁HF254。氧化鋁是一種堿性極性固定相，適用于堿性、中性物質(zhì)分離，也可以制備成中性或酸性氧化鋁，擴(kuò)大使用范圍。
(3)聚酰胺
含有酰氨基極性固定相，適用于酚類、醇類化合物的分離。
(4)纖維素
含有羥基的極性固定相，適用于分離親水性物質(zhì)。
在薄層色譜法中，展開劑的選擇主要根據(jù)被分離物質(zhì)的極性、吸附劑的活性以及展開劑本身的極性來(lái)決定。一般根據(jù)“相似相溶”原則來(lái)選擇展開劑，因此，分離極性大的物質(zhì)應(yīng)選擇極性大的溶劑作展開劑，分離極性小的物質(zhì)應(yīng)選擇極性小的溶劑作展開劑。
常用的展開劑極性順序依次為：石油醚＜環(huán)己烷＜四氯化碳＜苯＜甲苯＜乙醚＜氯仿＜乙酸乙酯＜正丁醇＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水。
吸附劑和展開劑的一般選擇原則是：非極性組分的分離選用活性強(qiáng)的吸附劑。用非極性展開劑；極性組分的分離。選用活性弱的吸附劑，用極性展開劑。實(shí)際工作中要經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。
6、操作方法
薄層色譜操作包括薄層板的制備、點(diǎn)樣、展開、顯色，后三種操作類似于紙色譜，在此只對(duì)薄層板的制備進(jìn)行簡(jiǎn)述。
薄層色譜中多用玻璃板作為載板，要求表面光滑、平整清潔，玻璃板的大小一般有4cm×20cm、10cm×20cm、2.5cm×7.5cm等不同規(guī)格?？芍苯訉⑽絼┲糜诓ＡО迳希夸伋删鶆虮樱右妆淮瞪?；現(xiàn)一般是將吸附劑與適量水研磨成稀糊狀，用玻璃棒涂布成一均勻薄層。薄層的厚度一般以250μm為宜，若要分離制備少量的純物質(zhì)，薄層厚度應(yīng)稍大些。鋪好的硅膠板在自然晾干后，需在105～110℃溫度下活化0.5～1h，然后再用。
7、應(yīng)用
薄層色譜分離效果好、靈敏度高、分離快速、顯色方便，應(yīng)用范圍非常廣泛。
參考資料：分析化學(xué)
