液相色譜分離法
發布時間：2017-09-01
色譜法又稱層析法或色層分析法，是一種物理化學分離方法。其分離原理是混合物中各組分在兩相之間溶解能力、吸附能力或其他親和作用的差別，使其在兩相中分配系數不同，當兩相做相對運動時，組分在兩相間進行連續多次分配，使得備組分被固定相保留的時間不同，從而按一定順序由固定相中流出，實現混合物中各組分的分離。其中的一相固定不動，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體(氣體或液體)，稱為流動相。
兩相及兩相的相對運動構成了色譜法的基礎，色譜分析過程中總是由一種流動相帶著被分離的物質流經固定相，從而使試樣中的各種組分分離。按照流動相聚集態不同，色譜法可分為氣相色譜和液相色譜；按固定相的形狀和操作方式，可分為紙色譜、薄層色譜和柱色譜；按照被分離物質在固定相中的作用原理不同，又可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠色譜。本節主要介紹紙色譜法和薄層色譜法。
一、紙色譜
1、分離原理
紙色譜法是以色譜用濾紙為載體的液相色譜法。分離原理一般認為是分配色譜。濾紙被看作是一種惰性載體，濾紙纖維素中吸附著的水為固定相，流動相又叫展開劑，既可用與水不相混溶的溶劑，也可用丙醇、乙醇、丙酮等與水混溶的溶劑，因為濾紙纖維素中所吸附20％～26％的水分中有6％左右通過氫鍵與纖維素上的羧基結合成復合物，故這部分水與和水相混溶的溶劑仍能形成類似不相混溶的兩相。
將試樣點在濾紙的一端，并將該端浸在展開劑中(圖9―3)，由于毛細作用，流動相自下而上不斷上升，經過試樣點時，帶動試樣向上運動，被分離的各組分將在固定相(水相)和流動相(有機相)之間不斷進行分配和再分配，分配比大的組分上升得快(圖9―4，B組分)，分配比小的組分上升得慢(圖9―4，A組分)，從而不同組分將會得到分離。如果這些組分顯色，將會在濾紙上顯現出若干個分開的色斑。
比移值在紙色譜分離法中，通常用比移值(Rf)來衡量各組分分離情況。Rf的定義為：組分的遷移距離與展開劑的遷移距離之比稱為比移值(圖9―4)。
由于組分被保留在濾紙上，它的移動距離總是小于展開劑的移動距離，因此，Rf總是小于1；如果Rf=0，則該組分不溶于展開劑，留在原點不動，分配比小；Rf=1，該組分不溶于固定相(水)，不被固定相保留，隨溶劑前沿一起移動，分配比大。
比移值是紙色譜的基本定性參數，它說明組分在色譜系統中的保留行為。Rf大小與組分性質、流動相及溶解度有關。極性組分易保留在固定相中，其Rf小，且隨流動相極性增強，Rf增大；非極性組分易流出，其Rf大，且隨流動相極性增強，Rf減小。由于影響Rf的因素很多，要想得到重復的Rf，就必須嚴格控制色譜條件的一致性。
根據比移值的差別的大小還可以進行分離可能性的判斷，兩組分的Rf值差別越大，分離效果越好，一般認為兩組分的△Rf＞0.02，兩組分即可得到完全分離。
2、操作方法
(1)濾紙的選擇要求
用于色譜分離的濾紙必須具備下述條件：①質地和厚薄必須均勻，邊緣整齊，平整無折痕，無污漬，不與試樣組分和吸附劑發生化學反應；②紙纖維疏松度適當，過于疏松易使斑點擴散，過于緊密則流速太慢；③有一定的強度，不易斷裂；④純度高，不含填充劑，灰分在O.01％以下，否則金屬離子雜質會與某些組分結合，影響分離效果。
(2)點樣
溶解樣品的溶劑、點樣量和正確的點樣方法對獲得好的分離非常重要。溶解樣品的溶劑最好用與展開劑極性類似的溶劑，盡量使點樣后溶劑能迅速揮發，以減小色斑的擴散。適當的點樣量，可使斑點集中，點樣量過大，易拖尾或擴散，點樣量過少，不易檢出。點樣時可用管口平整的玻璃毛細管或微量注射器，一張濾紙條可并排點上數點試液，兩點試液間應相距一定距離，原點愈小愈好，一般直徑以2～3mm為宜。
(3)展開劑的選擇
展開劑的選擇主要根據被分離物質的極性。一般先選擇單一溶劑，但對難分離組分，則需使用二元或三元溶劑(有機溶劑、酸和水)，通過比例調節展開劑的極性，改善分離效果。
展開劑各組分間以及它們與分離的物質問都不應發生反應；選擇的展開劑應使待測組分在兩相間迅速達到分配平衡。
(4)展開方法
一般用普通的豎式展開槽采用上行法展開，用培養皿可作徑向展開，還可采用下行展開法和二向展開法等。展開時，應將展開槽密封，防止溶劑揮發。
(5)顯色
對于有色物質，展開后即可直接觀察到各個色斑。對于無色物質，應用各種物理的和化學的方法使之顯色。由于很多有機化合物在紫外照射下，顯現其特有的熒光，故可在紫外光照射下，用鉛筆畫出熒光斑點，或用化學顯色法噴以適當的顯色劑如茚三酮正丁醇溶液、Fecl3水溶液等，也可以用碘蒸氣熏。注意的是，顯色之后應立即用鉛筆畫出各色斑點的位置，以免褪色或變色后不易尋找。
3、應用
紙色譜法試樣用量少，操作簡便，分離效果好，常應用于有機物的分離。例如：葡萄糖、麥芽糖和木糖混合糖類的分離，可采用正丁醇：冰醋酸：水=4∶1∶5(體積比)為展開劑，用硝酸銀氨溶液噴灑，即出現Ag的褐色斑點。其中，葡萄糖的Rf為0.16，麥芽糖的Rf為O．1l，木糖的Rf是0.28，由Rf值可判斷是哪種糖。又如甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸混合氨基酸的分離，采用的展開劑為：正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶2(體積比)，用茚三酮顯色。
4、薄層色譜分離法特點
薄層色譜分離法是將固定相吸附劑均勻地涂在玻璃上制成薄層板，試樣中的各組分在固定相和作為展開劑的流動相之間不斷地發生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配過程。不同物質上升的距離不一樣而形成相互分開的斑點從而達到分離。
相對于紙色譜，薄層色譜具有以下特點：①快速，展開的時間短。一般紙色譜需要幾小時至幾十小時，薄層色譜一般只需十幾分鐘或幾十分鐘。②使用無機吸附劑如硅膠做固定相，可以采用腐蝕性的顯色劑，如濃硫酸、濃鹽酸和濃磷酸。對于特別難以檢出的化合物，可噴以濃硫酸，然后小心加熱，使有機物碳化，顯棕色斑點，而紙色譜則無法檢出。③廣泛地選用各種固定相，比紙上色譜有顯著的靈活性。④紙色譜法斑點的擴散作用嚴重，降低了單位面積中樣品的濃度，降低檢出靈敏度。薄層色譜法擴散作用較少，斑點比較密集，檢測靈敏度較高。⑤薄層色譜法適于分析小量樣品(一般幾微克到幾十微克)，也適于大量樣品的分離(可以分離出幾毫克甚至幾十毫克組分)。
5、固定相和展開劑的選擇
薄層色譜中，固定相的選擇十分重要。常用的固定相吸附劑如下：
(1)硅膠
薄層用的硅膠粒度為10～40μm。不含黏合劑的硅膠稱硅膠H，硅膠中加入10％～15％煅石膏作黏合劑稱硅膠G。若在硅膠G中加入熒光物質稱硅膠GF254或硅膠GF254+364，表示在254nm或365nm紫外光下呈強烈黃綠色背景，適用于本身不發光又無適當顯色劑顯色的物質；最常用的是硅膠GF254。硅膠是一種微酸性極性固定相，適用于酸性、中性物質分離；在展開劑中加入少量酸或堿，可改變硅膠的酸堿性質，適合各種物質的分離。
(2)氧化鋁
氧化鋁與硅膠類似，有氧化鋁H、氧化鋁G、氧化鋁HF254。氧化鋁是一種堿性極性固定相，適用于堿性、中性物質分離，也可以制備成中性或酸性氧化鋁，擴大使用范圍。
(3)聚酰胺
含有酰氨基極性固定相，適用于酚類、醇類化合物的分離。
(4)纖維素
含有羥基的極性固定相，適用于分離親水性物質。
在薄層色譜法中，展開劑的選擇主要根據被分離物質的極性、吸附劑的活性以及展開劑本身的極性來決定。一般根據“相似相溶”原則來選擇展開劑，因此，分離極性大的物質應選擇極性大的溶劑作展開劑，分離極性小的物質應選擇極性小的溶劑作展開劑。
常用的展開劑極性順序依次為：石油醚＜環己烷＜四氯化碳＜苯＜甲苯＜乙醚＜氯仿＜乙酸乙酯＜正丁醇＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水。
吸附劑和展開劑的一般選擇原則是：非極性組分的分離選用活性強的吸附劑。用非極性展開劑；極性組分的分離。選用活性弱的吸附劑，用極性展開劑。實際工作中要經過多次實驗來確定。
6、操作方法
薄層色譜操作包括薄層板的制備、點樣、展開、顯色，后三種操作類似于紙色譜，在此只對薄層板的制備進行簡述。
薄層色譜中多用玻璃板作為載板，要求表面光滑、平整清潔，玻璃板的大小一般有4cm×20cm、10cm×20cm、2.5cm×7.5cm等不同規格。可直接將吸附劑置于玻璃板上，涂鋪成均勻薄層，但薄層易被吹散；現一般是將吸附劑與適量水研磨成稀糊狀，用玻璃棒涂布成一均勻薄層。薄層的厚度一般以250μm為宜，若要分離制備少量的純物質，薄層厚度應稍大些。鋪好的硅膠板在自然晾干后，需在105～110℃溫度下活化0.5～1h，然后再用。
7、應用
薄層色譜分離效果好、靈敏度高、分離快速、顯色方便，應用范圍非常廣泛。
參考資料：分析化學
