高效液相色譜法方法
發布時間：2017-09-01
一、引言
以液體為流動相的色譜體系稱為液相色譜。柱色譜、薄層色譜、紙色譜等都屬于此類色譜。最早的液相色譜(經典液相色譜)是1906年俄國植物學家Tswett在分離植物色素時建立的一種分離方法。它的原理是借助于樣品中各組分分子在流動相(淋洗液)和固定相(色譜柱)之間作用力的差別而進行分離。
高效液相色譜法(high performance liquid chromatography， HPLC)是在經典液相色譜法的基礎上，隨著現代科學技術的發展而發展起來的一種高效、高速、高靈敏度的現代化分離方法。由于固定相和流動相的多樣性，分離機理也是多種多樣的，從原理上講，只要是能溶解在流動相中的物質都可以用高效液相色譜來分離和分析。
高效液相色譜與氣相色譜的主要區別在于高效液相色譜中的分離作用，是依據樣品分子與固定相和流動相三者之間的作用力差別，而氣相色譜是依據樣品分子與固定相之間作用力的差別(流動相幾乎不參與分離作用)，高效液相色譜分析的是液體樣品，可以在室溫下進行分離，而氣相色譜分析的是氣體樣品或是在高溫下可以氣化的樣品，因此高效液相色譜法的應用范圍非常廣泛。在目前已知的有機化合物中，大約有80％的有機化合物可以用高效液相色譜法分析。
半經驗性的塔板理論和范第姆特的速率理論以及用于氣相色譜中的一些定性定量方法仍然適用于高效液相色譜。聯用技術在高效液相色譜定性方面起著重要的作用，目前應用較普遍的是高效液相色譜一質譜(HPLC-MS)，其他還有高效液相色譜-激光拉曼光譜、高效液相色譜-原子吸收光譜等。
二、方法原理
1、吸附色譜
吸附色譜(adsorption chromatography)也稱液-固色譜，其固定相是固體吸附劑，常用的有硅膠、氧化鋁、活性炭等無機吸附劑。硅膠是一種多孔性物質，因-O-Si(-O-)-O-Si(-O-)-O-結合而具有三維結構，表面具有硅羥基(≡Si-OH)，此硅羥基呈微酸性，易與氫結合，是吸附的活性點。在吸附色譜中，樣品主要靠氫鍵結合力吸附到硅羥基上，和流動相分子競爭吸附點，反復地被吸附，又反復地被流動相分子頂替解吸，隨著流動相的流動而在柱中向前移動。因為不同的待測分子在固定相表面的吸附能力不同，因而吸附一解吸的速度不同，各組分被洗出的時間(保留時間)也就不同，使得各組分彼此分離。吸附色譜在早期的HPLC中應用得較多，現在被更方便和更有效的化學鍵合相反相分配色譜所代替。由于硅羥基活性點在硅膠表面常按一定幾何規律排列，因此吸附色譜用于異構體的分離和族分離仍是最有效的方法。
2、分配色譜
分配色譜(partion chromatography)原本是基于樣品分子在包覆于惰性載體(基質)上的固定相液體和流動相液體之間的分配平衡的色譜方法，因此也稱液一液色譜。因為作固定相的液體往往容易溶解到流動相中去，所以重現性很差。如果將固定相通過化學鍵合的方法鍵合到惰性載體上，固定相就不會流失到流動相中去?；谶@種思想發展起來的固定相就是當今在HPLC中應用最廣泛的化學鍵合型固定相。如ODS(octa decyltrichloro silane，十八烷基三氯硅烷)固定相就是最典型的代表，它是將十八烷基三氯硅烷通過化學反應與硅膠表面的硅羥基結合，在硅膠表面形成化學鍵合態的十八碳烷基，其極性很小，而常用的流動相，如甲醇、乙腈以及它們與水的混合溶液，極性比固定相大，被稱作反相HPLC。相反，如流動相的極性比固定相小，被稱作正相HPLC。
3、離子交換色譜
離子交換色譜是根據不同樣品離子與固定相(離子交換樹脂)離子基團親和力的差異而進行分離的一種色譜方法。固定相可用陽離子交換劑和陰離子交換劑或鍵合相的離子交換劑。流動相多采用鹽類的緩沖溶液，通過改變流動相的pH值、離子強度，或加入有機溶液、配位劑等改變固定相的選擇性，以獲得樣品的良好分離。
4、凝膠色譜
凝膠色譜是根據樣品分子的尺寸不同而達到分離，因而凝膠色譜又常被稱作體積排阻或空間排阻色譜。
凝膠色譜是以多孔性填料作固定相。樣品分子的分離受填料孔徑的影響，比填料孔徑大的樣品分子不能進入填料的孔內，最先流出色譜柱；填料顆粒上有很多不同尺寸的孔，在那些可以進入填料孔內的樣品分子中，體積較大的樣品分子可以利用的孔少，所以樣品分子按體積從大到小的順序依次流出色譜柱。在凝膠色譜中，流動相的作用不是為了參與分離，而是為了溶解樣品或減小流動相黏度。以有機溶劑作流動相的稱為凝膠滲透色譜(gel permeation chromategraphy，GPC)，以水溶液作流動相的稱為凝膠過濾色譜。
參考資料：現代儀器分析實驗與技術
