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高效液相色譜法α-VE在反相HPLC上的定量分析
發(fā)布時(shí)間：2017-09-01
1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
(1)熟悉高效液相色譜儀的操作方法。
(2)了解反相鍵合相色譜的原理和應(yīng)用。
(3)了解紫外檢測(cè)器的原理、應(yīng)用以及最佳波長(zhǎng)選擇的重要性。
2、實(shí)驗(yàn)原理
反相色譜與正相色譜組成相反，是以非極性或弱極性的固定液制成的固定相，以極性或相對(duì)強(qiáng)的極性溶劑作為流動(dòng)相組成的液-液分配色譜。但目前多是采用化學(xué)反應(yīng)的方法將非極性或弱極性的有機(jī)物分子鍵合到載體表面，制成鍵合相的固定相，所以也稱(chēng)鍵合相色譜。這種色譜的分離機(jī)理比較復(fù)雜，一般認(rèn)為是液-固吸附和液-液分配并存。
在反相HPLC中常用的鍵合相有十八烷基硅烷(C18)、辛基硅烷(C8)、氰基硅烷、氨基硅烷等。常用的溶劑有甲醇、乙腈、水等。有時(shí)需要加入某種修飾劑以獲得良好的分離。例如利用反相鍵合相色譜分離弱酸時(shí)為了抑制它的解離，須在乙腈／水或甲醇／水流動(dòng)相中加入少量的乙酸。
一般反相鍵合相色譜適用于分離極性較弱的樣品，α-VE在其多種異構(gòu)體中極性是最弱的一種，在C18柱上有較強(qiáng)的保留，最后流出色譜柱。δ-VE極性較強(qiáng)，最先流出色譜柱。
α-VE在220nm和292nm處有兩個(gè)明顯的紫外吸收峰，本實(shí)驗(yàn)選擇292nm作為定量分析的檢測(cè)波長(zhǎng)，以排除其他物質(zhì)的干擾，確保定量準(zhǔn)確。
3、儀器與試劑
儀器：高效液相色譜儀、紫外檢測(cè)器、流動(dòng)相脫氣裝置。
試劑：無(wú)水乙醇：分析純；
甲醇：色譜純；
水：重蒸去離子水；
α-VE標(biāo)樣溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)量α-VE標(biāo)樣，用無(wú)水乙醇配制，濃度約1000mg／L；混合VE溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)量混合VE樣品，用無(wú)水乙醇溶解并定容至250ml容量瓶中)。
4、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟
(1)按照儀器操作說(shuō)明開(kāi)機(jī)。
(2)設(shè)置色譜儀參數(shù)：色譜柱為C㈤流動(dòng)相為甲醇／水(體積比為100／0)，流速為1.0mL／min，柱溫30℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為292nm，進(jìn)樣量20μL。
(3)檢查流路確無(wú)氣泡后，啟動(dòng)色譜系統(tǒng)，待基線穩(wěn)定。
(4)注入v。混合樣品，待樣品中所有色譜峰流出后結(jié)束分析。
(5)將流動(dòng)相配比變?yōu)榧状迹疄?7／3(體積比)，重復(fù)(4)的操作，比較分離情況。
(6)注入α-VE標(biāo)樣，用保留時(shí)間確認(rèn)VE混合樣品中α-VE峰位。
(7)改變檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，重復(fù)(4)的操作，比較檢測(cè)結(jié)果。
(8)調(diào)整到最佳色譜條件(包括流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、流速、柱溫等)，待基線穩(wěn)定。
(9)稀釋?duì)?VE標(biāo)樣，使?jié)舛扰cVE混合物中α-VE的濃度相匹配(峰面積值相近)。
(10)注入稀釋后的α-VE標(biāo)樣，重復(fù)3次(面積誤差小于3％)，取平均值。
(11)注入混合VE樣品，重復(fù)3次(峰面積誤差小于3％)，取平均值。
(12)按儀器操作說(shuō)明關(guān)機(jī)。
5、注意事項(xiàng)
(1)紫外檢測(cè)器靈敏度較高，定性時(shí)可將a―Ve標(biāo)樣稀釋至50～100mg／L。
(2)選擇最佳色譜條件時(shí)既要注意分離度又要考慮到分析時(shí)間，盡量做到高效、高速、高靈敏度。
6、數(shù)據(jù)處理
(1)計(jì)算不同流動(dòng)相組成時(shí)α-VE的分離度。
(2)用外標(biāo)法計(jì)算V。混合物中α-VE的含量。
參考資料：現(xiàn)代儀器分析實(shí)驗(yàn)與技術(shù)
