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生化分析儀常用分析方法
發(fā)布時(shí)間：2017-09-01
自動(dòng)生化分析儀是集電子學(xué)、光學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)和各種生物化學(xué)分析技術(shù)于一體的臨床生物化學(xué)檢測(cè)的主要工具。它的分析方法基于常規(guī)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基本方法，如終點(diǎn)法、連續(xù)監(jiān)測(cè)法和比濁法等，借助儀器的機(jī)械和電子裝置做進(jìn)一步擴(kuò)展。常用的自動(dòng)生化分析儀分析方法主要有：
(一)終點(diǎn)分析法(平衡法)
終點(diǎn)分析法是通過(guò)測(cè)定反應(yīng)開(kāi)始至反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)的產(chǎn)物或底物濃度的總變化量求出待測(cè)物質(zhì)濃度或活性的方法。它的反應(yīng)是基于反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜特征及其對(duì)光吸收強(qiáng)度的大小，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析的一類方法。根據(jù)時(shí)問(wèn)一吸光度曲線變化，反應(yīng)到達(dá)平衡時(shí)吸光度不再變化。終點(diǎn)法參數(shù)設(shè)置簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間一般較長(zhǎng)，精密度較好。
終點(diǎn)時(shí)間的確定：①根據(jù)時(shí)間一吸光度曲線來(lái)確定，如Trinder反應(yīng)測(cè)定尿酸，反應(yīng)曲線上3～5分鐘時(shí)其吸光度已經(jīng)趨向穩(wěn)定，因而可將5分鐘作為反應(yīng)終點(diǎn)。②根據(jù)被測(cè)物質(zhì)反應(yīng)終點(diǎn)結(jié)合干擾物的反應(yīng)情況來(lái)確定，如在溴甲酚綠法測(cè)定血清白蛋白時(shí)，白蛋白與溴甲酚綠在10秒內(nèi)很快完成反應(yīng)，之后α-球蛋白與β-球蛋白與溴甲酚綠發(fā)生“慢反應(yīng)”，使反應(yīng)曲線上吸光度在10秒后仍繼續(xù)緩慢上升，持續(xù)約10分鐘，因此終點(diǎn)時(shí)間應(yīng)采用10～30秒，而不選擇10分鐘。
1、一點(diǎn)終點(diǎn)法指樣品和試劑混合后發(fā)生反應(yīng)，在時(shí)間一吸光度曲線上吸光度不再改變，選擇一個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度計(jì)算出待測(cè)物濃度，相應(yīng)反應(yīng)曲線見(jiàn)圖19-6。臨床常用于總蛋白和白蛋白等項(xiàng)目的測(cè)定，該法簡(jiǎn)便，但易受樣品、試劑顏色、血清濁度及干擾物的影響。
其檢測(cè)結(jié)果的計(jì)算公式是：待測(cè)物濃度CU=(待測(cè)吸光度AU-試劑空白吸光度AB)×K。K為校準(zhǔn)系數(shù)。
2、兩點(diǎn)終點(diǎn)法在第二試劑加入以前，選擇某一點(diǎn)讀取吸光度值A(chǔ)1，它就要由樣品本身或第一試劑與樣品的非特異反應(yīng)引起，相當(dāng)于樣品空白；加入第二試劑后經(jīng)過(guò)一定時(shí)間反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)(平衡)后選擇第二個(gè)點(diǎn)讀取吸光度A2，△A=A2-A1，據(jù)此計(jì)算待測(cè)物濃度，此稱為兩點(diǎn)終點(diǎn)法。需要注意的是，A1與A2測(cè)定時(shí)反應(yīng)體積不同，因此需采用體積校正因子K0進(jìn)行校正，K0=(Sv+R1)／(Sv+R1+R2)。目前的全自動(dòng)生化分析儀除Dade dimension需用戶設(shè)定K0外，其他型號(hào)的儀器均具有此自動(dòng)校正功能，不必手工進(jìn)行校正。兩點(diǎn)終點(diǎn)法的優(yōu)點(diǎn)是可以消除在測(cè)定波長(zhǎng)樣品自身的吸光度，如溶血、黃疸和脂血，以及一些干擾物質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾。
(二)固定時(shí)間法
固定時(shí)間法是指在時(shí)間-吸光度曲線上選擇兩個(gè)測(cè)光點(diǎn)，此兩點(diǎn)既非反應(yīng)初始吸光度，亦非終點(diǎn)吸光度，這兩點(diǎn)的吸光度差值用于結(jié)果計(jì)算。這種方法有助于解決某些反應(yīng)的非特異性問(wèn)題。即樣品和試劑混合后分別讀取延滯期后的吸光度A1和反應(yīng)一定時(shí)間的吸光度A2，A=A2一A1，然后比較標(biāo)準(zhǔn)和測(cè)定的A值，計(jì)算待測(cè)物質(zhì)的濃度(圖19-7)。
例如，苦味酸法測(cè)定肌酐，反應(yīng)最初的30秒內(nèi)，血清中快反應(yīng)干擾物(如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等)能與堿性苦味酸反應(yīng)；在第二個(gè)30秒堿性苦味酸主要與肌酐反應(yīng)，且此段時(shí)間-吸光度曲線的線性較好；在80～120秒及其以后，堿性苦味酸可與蛋白質(zhì)以及其他慢反應(yīng)干擾物反應(yīng)。這樣選用反應(yīng)的第二個(gè)30秒為測(cè)定時(shí)間，同時(shí)避免了快反應(yīng)物質(zhì)和慢反應(yīng)物質(zhì)的干擾，使肌酐濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系，有利于提高分析的特異性和準(zhǔn)確度。
(三)連續(xù)監(jiān)測(cè)法
連續(xù)監(jiān)測(cè)法是通過(guò)連續(xù)測(cè)定反應(yīng)過(guò)程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物的吸光度，根據(jù)吸光度的變化速率(△A/min)來(lái)計(jì)算待測(cè)物濃度或活性的方法，又稱速率法、動(dòng)態(tài)分析法或動(dòng)力學(xué)法。
酶活性測(cè)定常用連續(xù)監(jiān)測(cè)法，其檢測(cè)原理是在酶促反應(yīng)的最適條件下，用物理、化學(xué)或酶促反應(yīng)的分析方法，在反應(yīng)速度恒定期(零級(jí)反應(yīng)期)連續(xù)觀察和記錄一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物生成量的變化。以單位時(shí)間酶促反應(yīng)初速度計(jì)算出酶活力的大小或代謝物的濃度。連續(xù)監(jiān)測(cè)法主要適用于酶活性及其代謝產(chǎn)物的測(cè)定，可將多點(diǎn)測(cè)定結(jié)果連成線，自動(dòng)選擇線性反應(yīng)期計(jì)算酶活性或濃度。因其可觀察反應(yīng)的過(guò)程，相對(duì)減少了誤差，大大提高了分析速度和準(zhǔn)確性。連續(xù)監(jiān)測(cè)法要求在酶促反應(yīng)的零級(jí)反應(yīng)期測(cè)定，此時(shí)產(chǎn)物生成量或底物減少量與反應(yīng)時(shí)間成正比；反應(yīng)速度與酶量需呈線性關(guān)系，同時(shí)考慮影響酶促反應(yīng)的因素，如底物的種類和濃度、pH、溫度、激活劑與抑制劑等。其檢測(cè)方法都是在反應(yīng)的線性期連續(xù)觀察，計(jì)算出單位時(shí)間內(nèi)的吸光度。其具體方法有：
1、兩點(diǎn)速率法在酶促反應(yīng)的零級(jí)反應(yīng)期，觀察兩個(gè)時(shí)問(wèn)點(diǎn)的吸光度變化，用兩個(gè)吸光度的差值(△A)除以時(shí)問(wèn)(分鐘)，得到每分鐘的吸光度，計(jì)算酶活性或濃度。
2、多點(diǎn)速率法 即在酶促反應(yīng)的零級(jí)反應(yīng)期，每隔一定時(shí)間(2~30秒)監(jiān)測(cè)一次，連續(xù)監(jiān)測(cè)多次，求出單位時(shí)間內(nèi)吸光度的變化，計(jì)算酶活性或濃度。這種方法可分為：
(1)最小二乘法：通過(guò)最小平方法求得單位時(shí)間內(nèi)的吸光度變化，得到樣品中待測(cè)物質(zhì)的濃度或活性。該方法是全自動(dòng)生化分析儀上最常用的速率法。
(2)多點(diǎn)δ(delta)法：求出各點(diǎn)吸光度差值即δ=An一Ann-1，取符合線性反應(yīng)段的δ值，計(jì)算酶濃度或活性。
(3)回歸法：該法是對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，去掉斜率值過(guò)大或過(guò)小的部分，計(jì)算酶濃度或活力。此法能有效克服因酶活力不同所致反應(yīng)曲線不一樣和零級(jí)反應(yīng)期的時(shí)間不同帶來(lái)的誤差，客觀地確定每一個(gè)樣品的線性反應(yīng)段來(lái)讀取吸光度，提高了測(cè)定的準(zhǔn)確性。
(4)速率時(shí)問(wèn)法：速率時(shí)間法是由于連續(xù)觀測(cè)的間隔時(shí)間太短，產(chǎn)物生成或底物減少的量太少，形成的信號(hào)較弱，無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)而采用的一種方法。儀器設(shè)計(jì)中設(shè)立了速率時(shí)間(即讀數(shù)的總時(shí)間)這一參數(shù)，計(jì)算機(jī)按照速率時(shí)間的信號(hào)計(jì)算結(jié)果，這樣可以在不減少數(shù)據(jù)點(diǎn)的情況下，增大讀數(shù)點(diǎn)的值，降低誤差，提高準(zhǔn)確度。
此外，連續(xù)監(jiān)測(cè)法中還有雙項(xiàng)同時(shí)測(cè)定連續(xù)監(jiān)測(cè)法、三點(diǎn)雙項(xiàng)同時(shí)測(cè)定法等，在此不一一介紹。
(四)比濁測(cè)定法
比濁法是一種通過(guò)檢測(cè)物質(zhì)對(duì)光的散射或透射強(qiáng)度來(lái)測(cè)定物質(zhì)的方法。比濁法可分為化學(xué)比濁法和免疫比濁法，免疫比濁法又可分為透射比濁法和散射比濁法。自動(dòng)生化分析儀一般只能做透射比濁分析。透射比濁法是在光源的光路方向測(cè)量透光強(qiáng)度，它常用于終點(diǎn)法測(cè)定。目前自動(dòng)生化分析儀常用的比濁法是免疫透射比濁法，主要用于血清特種蛋白的檢測(cè)，如載脂蛋白、免疫球蛋白、微量蛋白、急性時(shí)相反應(yīng)蛋白以及某些藥物監(jiān)測(cè)等。
參考資料：分析化學(xué)
