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動物性食品中甲硝唑、地美硝唑及其代謝物殘留檢測方法――超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法（一）
發(fā)布時間：2017-09-01
1、安全要求
實驗操作時穿工作服、戴口罩和手套；提取和凈化操作都應在通風櫥中進行，避免溶劑氣體吸入和皮膚接觸；廢棄的化學試劑收集到專用容器中集中處理。
2、急救措施
皮膚接觸到有機溶劑或酸、堿溶液后用清水清洗，有機溶劑或酸、堿溶液濺入眼中用清水灌洗。
3、適用范圍
該標準操作規(guī)程適用于豬肌肉和豬肝臟組織中甲硝唑、地美硝唑、甲硝唑的代謝產(chǎn)物羥基甲硝唑、地美硝唑的代謝產(chǎn)物羥甲基甲硝唑殘留量的確證檢測。
4、職責
進行該項檢驗的檢驗員必須按該標準操作規(guī)程進行檢驗，質(zhì)量監(jiān)督員負責監(jiān)督該標準操作規(guī)程正確執(zhí)行。
5、檢測原理
用乙酸乙酯提取試樣中的硝基咪唑類藥物及其代謝物，經(jīng)O.1m0l/L鹽酸溶液-正己烷溶液分配除脂，再經(jīng)MCX固相萃取柱凈化，液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法檢測，色譜保留時間和質(zhì)譜碎片離子共同定性，外標法定量。
6、方法靈敏度
甲硝唑、地美硝唑、甲硝唑的代謝產(chǎn)物羥基甲硝唑、地美硝唑的代謝產(chǎn)物羥甲基甲硝唑在豬肌肉和豬肝臟組織中的檢測限為0.2μg/kg，定量限為1μg/kg 。
7、注意事項
在固相萃取預洗、淋洗和洗脫過程中應注意流速，不能過快或過慢。
8、材料、儀器、試劑的準備及基本要求
除特別注明外，以下所用試劑均為分析純；水為符合GB/T6682規(guī)定的一級水。
8.1 對照品、試劑和藥物儲備液、工作液準備
8.1.1 甲硝唑?qū)φ掌?metronidazole，MNZ)純度≥98％
8.1.2地美硝唑?qū)φ掌?Dimetridazole，DMZ)純度≥98％
8.1.3羥基甲硝唑?qū)φ掌?Metronidazole-OH，MNZOH)純度≥94％
8.1.4羥甲基甲硝咪唑?qū)φ掌?2-Hydroxymethyl-1-methyl-5-nitro-1H-imidazole，HMMNI)純度≥94％
8.1.5乙酸乙酯
8.1.6乙腈 色譜純
8.1.7甲醇 色譜純
8.1.8鹽酸
8.1.9正己烷
8.1.10氨水
8.1.11 0.1mol/L鹽酸溶液 取9mL濃鹽酸，加水稀釋至100mL。
8.1.12標準儲備液的配制(100μg/mL) 精密稱取甲硝唑、地美硝唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑?qū)φ掌犯骷s10mg，置同一100mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即成濃度為100μg/mL的標準儲備液。一20℃以下保存，有效期為6個月。
8.1.13標準工作液的配制(20ng/mL) 精密量取標準儲備液0.1mL置10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即成1μg/mL的標準溶液；從中精密量取0.2mL，置lOmL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻即成20ng/mL的標準工作液。一200C以下保存，有效期為6個月。
8.2儀器和設(shè)備
8.2.1超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)
8.2.2組織勻漿機
8.2.3天平 感量0.01g
8.2.4分析天平 感量0.00001g
8.2.5渦旋混合器
8.2.6振蕩器
8.2.7離心機
8.2.8樣品濃縮器
8.2.9旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀
8.2.10固相萃取裝置
8.2.11 Oasis MCX固相萃取柱(60mg/3mL)，或相當者
8.2.12微孔濾頭0.2μm
9、檢驗步驟
9.1試料的制備
9.1.1 取制備后的供試樣品，作為供試試料。
9.1.2取制備后的空白樣品(2±0.02)g，作為空白試料(陰性對照)。
9.1.3取制備后的空白樣品(2±0.02)g，添加20μg/mL的混合標準工作液0.2mL，作為空白添加試料(陽性對照)。
9.2提取
9.2.1稱取供試樣品(2±O.02)g置．50mL離心管中，加入乙酸乙酯15mL，渦動2min，4000r／min離心5min。
9.2.2轉(zhuǎn)移上清液至100mL雞心瓶中，殘渣用乙酸乙酯15mL重復提取一次。
9.2.3合并兩次提取液，400C水浴下旋蒸濃縮至干。
9.3凈化
9.3.1向雞心瓶中加入0.1mol/L鹽酸3mL，渦動lmin充分溶解殘渣，轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。
9.3.2 向雞心瓶中加入正己烷3mL搖1min，轉(zhuǎn)移至同一離心管中，手搖20次，4000r/min離心5min。
9.3.3棄去正己烷層，再加入0.1mol/L鹽酸3mL，渦動1min。
9.3.4合并兩次鹽酸溶解液，加正己烷3mL重復去脂一次，除去正己烷層，備用。
9.3.5將MCX固相萃取柱置于固相萃取裝置上，依次用甲醇，0.1mol/L鹽酸各2mL預洗活化。
9.3.6取全部備用液在重力作用下自然流過小柱。
9.3.7再依次用O.1mol/L鹽酸、甲醇、甲醇-2％氨水(10+90，v/v)各1mL淋洗，在重力下流干。
9.3.8用甲醇-5％氨水(60+40，v/v)3mL進行洗脫。
9.3.9洗脫液在40℃水浴下用氮氣吹干，殘余物用流動相1mL溶解，過0.2μm有機濾膜，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。
9.4測定條件
9.4.1色譜條件
9.4.1.1 色譜柱： BEH C18(50mm×2.1mm)，粒徑1.7μm，或相當者；
9.4.1.2柱溫：30℃；
9.4.1.3進樣量：10μL；
9.4.1.4流動相A：乙腈；
流動相B：水；
流動相梯度洗脫條件見表1。
9.4.2質(zhì)譜條件
9.4.2.1離子源參考參數(shù)，見表2。
9.4.2.2質(zhì)量分析器參考參數(shù)見表3。
9.4.2.3光電倍增器電壓：650V。
9.4.2.4定性、定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量見表4。
參考資料：獸藥殘留檢測標準操作規(guī)程
