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動物性食品中甲硝唑、地美硝唑及其代謝物殘留檢測方法――超高效液相色譜一串聯質譜法（一）
發布時間：2017-09-01
1、安全要求
實驗操作時穿工作服、戴口罩和手套；提取和凈化操作都應在通風櫥中進行，避免溶劑氣體吸入和皮膚接觸；廢棄的化學試劑收集到專用容器中集中處理。
2、急救措施
皮膚接觸到有機溶劑或酸、堿溶液后用清水清洗，有機溶劑或酸、堿溶液濺入眼中用清水灌洗。
3、適用范圍
該標準操作規程適用于豬肌肉和豬肝臟組織中甲硝唑、地美硝唑、甲硝唑的代謝產物羥基甲硝唑、地美硝唑的代謝產物羥甲基甲硝唑殘留量的確證檢測。
4、職責
進行該項檢驗的檢驗員必須按該標準操作規程進行檢驗，質量監督員負責監督該標準操作規程正確執行。
5、檢測原理
用乙酸乙酯提取試樣中的硝基咪唑類藥物及其代謝物，經O.1m0l/L鹽酸溶液-正己烷溶液分配除脂，再經MCX固相萃取柱凈化，液相色譜一串聯質譜法檢測，色譜保留時間和質譜碎片離子共同定性，外標法定量。
6、方法靈敏度
甲硝唑、地美硝唑、甲硝唑的代謝產物羥基甲硝唑、地美硝唑的代謝產物羥甲基甲硝唑在豬肌肉和豬肝臟組織中的檢測限為0.2μg/kg，定量限為1μg/kg 。
7、注意事項
在固相萃取預洗、淋洗和洗脫過程中應注意流速，不能過快或過慢。
8、材料、儀器、試劑的準備及基本要求
除特別注明外，以下所用試劑均為分析純；水為符合GB/T6682規定的一級水。
8.1 對照品、試劑和藥物儲備液、工作液準備
8.1.1 甲硝唑對照品(metronidazole，MNZ)純度≥98％
8.1.2地美硝唑對照品(Dimetridazole，DMZ)純度≥98％
8.1.3羥基甲硝唑對照品(Metronidazole-OH，MNZOH)純度≥94％
8.1.4羥甲基甲硝咪唑對照品(2-Hydroxymethyl-1-methyl-5-nitro-1H-imidazole，HMMNI)純度≥94％
8.1.5乙酸乙酯
8.1.6乙腈 色譜純
8.1.7甲醇 色譜純
8.1.8鹽酸
8.1.9正己烷
8.1.10氨水
8.1.11 0.1mol/L鹽酸溶液 取9mL濃鹽酸，加水稀釋至100mL。
8.1.12標準儲備液的配制(100μg/mL) 精密稱取甲硝唑、地美硝唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑對照品各約10mg，置同一100mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即成濃度為100μg/mL的標準儲備液。一20℃以下保存，有效期為6個月。
8.1.13標準工作液的配制(20ng/mL) 精密量取標準儲備液0.1mL置10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即成1μg/mL的標準溶液；從中精密量取0.2mL，置lOmL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻即成20ng/mL的標準工作液。一200C以下保存，有效期為6個月。
8.2儀器和設備
8.2.1超高效液相色譜-串聯質譜儀(配電噴霧離子源)
8.2.2組織勻漿機
8.2.3天平 感量0.01g
8.2.4分析天平 感量0.00001g
8.2.5渦旋混合器
8.2.6振蕩器
8.2.7離心機
8.2.8樣品濃縮器
8.2.9旋轉蒸發儀
8.2.10固相萃取裝置
8.2.11 Oasis MCX固相萃取柱(60mg/3mL)，或相當者
8.2.12微孔濾頭0.2μm
9、檢驗步驟
9.1試料的制備
9.1.1 取制備后的供試樣品，作為供試試料。
9.1.2取制備后的空白樣品(2±0.02)g，作為空白試料(陰性對照)。
9.1.3取制備后的空白樣品(2±0.02)g，添加20μg/mL的混合標準工作液0.2mL，作為空白添加試料(陽性對照)。
9.2提取
9.2.1稱取供試樣品(2±O.02)g置．50mL離心管中，加入乙酸乙酯15mL，渦動2min，4000r／min離心5min。
9.2.2轉移上清液至100mL雞心瓶中，殘渣用乙酸乙酯15mL重復提取一次。
9.2.3合并兩次提取液，400C水浴下旋蒸濃縮至干。
9.3凈化
9.3.1向雞心瓶中加入0.1mol/L鹽酸3mL，渦動lmin充分溶解殘渣，轉移至15mL離心管中。
9.3.2 向雞心瓶中加入正己烷3mL搖1min，轉移至同一離心管中，手搖20次，4000r/min離心5min。
9.3.3棄去正己烷層，再加入0.1mol/L鹽酸3mL，渦動1min。
9.3.4合并兩次鹽酸溶解液，加正己烷3mL重復去脂一次，除去正己烷層，備用。
9.3.5將MCX固相萃取柱置于固相萃取裝置上，依次用甲醇，0.1mol/L鹽酸各2mL預洗活化。
9.3.6取全部備用液在重力作用下自然流過小柱。
9.3.7再依次用O.1mol/L鹽酸、甲醇、甲醇-2％氨水(10+90，v/v)各1mL淋洗，在重力下流干。
9.3.8用甲醇-5％氨水(60+40，v/v)3mL進行洗脫。
9.3.9洗脫液在40℃水浴下用氮氣吹干，殘余物用流動相1mL溶解，過0.2μm有機濾膜，供高效液相色譜-串聯質譜儀測定。
9.4測定條件
9.4.1色譜條件
9.4.1.1 色譜柱： BEH C18(50mm×2.1mm)，粒徑1.7μm，或相當者；
9.4.1.2柱溫：30℃；
9.4.1.3進樣量：10μL；
9.4.1.4流動相A：乙腈；
流動相B：水；
流動相梯度洗脫條件見表1。
9.4.2質譜條件
9.4.2.1離子源參考參數，見表2。
9.4.2.2質量分析器參考參數見表3。
9.4.2.3光電倍增器電壓：650V。
9.4.2.4定性、定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量見表4。
參考資料：獸藥殘留檢測標準操作規程
