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動物源食品中8種氨基糖苷類藥物殘留檢測方法――超高效液相色譜一串聯質譜法(一)
發布時間：2017-09-01
1、安全要求
實驗操作時穿工作服、戴口罩和手套；提取和凈化操作都應在通風櫥中進行，避免溶劑氣體吸人和皮膚接觸；廢棄的化學試劑收集到專用容器中集中處理。
2、急救措施
皮膚接觸到有機溶劑或酸、堿溶液后用清水清洗，有機溶劑或酸、堿溶液濺入眼中用清水灌洗。
3、適用范圍
該標準操作規程適用于牛奶、豬肌肉、豬肝臟和豬腎臟中鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素C1、卡那霉素、阿米卡星、大觀霉素、安普霉素和新霉素8種氨基糖苷類藥物單個或混合物殘留量的確證檢測。
4、職責
進行該項檢驗的檢驗員必須按該標準操作規程進行檢驗，質量監督員負責監督該標準操作規程的正確執行。
5、檢測原理
供試樣品經磷酸二氫鉀緩沖溶液提取后，調其pH值，經CBX固相萃取柱凈化，濃縮后殘余物用HFBA溶液溶解，供超高效液相色譜-串聯質譜法測定。
6、方法靈敏度
鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素C1、卡那霉素、阿米卡星、大觀霉素、安普霉素和新霉素在牛奶、豬肌肉、豬肝臟和豬腎臟中的檢測限為5μg/kg，定量限為10μg/kg。
7、注意事項
操作過程中盡可能用塑料試管，不用玻璃試管。
8、材料、儀器、試劑的準備及基本要求
除特別注明外，以下所用試劑均為分析純；水為符合GB/T6682規定的一級水。
8.1對照品、試劑和藥物儲備液、工作液準備
8.1.1鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素C1、卡那霉素、阿米卡星、大觀霉素、安普霉素和新霉素對照品 純度均大于98.0％。
8.1.2甲醇 色譜純
8.1.3乙腈 色譜純
8.1.4磷酸二氫鉀
8.1.5三氯乙酸
8.1.6 Na2EDTA(含2個結晶水)
8.1.7乙酸
8.1.8七氟丁酸酐(HFBA)
8.1.9 10mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液(含0.4mmol/L EDTA和2％三氯乙酸) 稱取2.72g磷酸二氫鉀，溶解于2L水中，用lmol/L鹽酸溶液調pH值至4.0；再加入0.3gNa2EDTA(含2個結晶水)和40g三氯乙酸，混勻即得。
8.1.10 10％乙酸甲醇溶液量取5mL乙酸，溶于45mL甲醇中，混勻即得。
8.1.1 1 30％氫氧化鈉溶液稱取30g氫氧化鈉，用水溶解并稀釋至100mL，混勻即得。
8.1.12 1tool／L鹽酸溶液取9mL鹽酸，加水稀釋至100mL，混勻即得。
8.1.13 5mmol/L七氟丁酸酐(HFBA)取0.25mL HFBA，加水稀釋至200mL，混勻即得。
8.1.14氨基糖苷類藥物標準儲備液(1mg/mL) 準確稱取適量的鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素C1、卡那霉素、阿米卡星、大觀霉素、安普霉素和新霉素標準品，用水分別配制成lmg/mL的標準儲備液。配制完后都轉移至塑料試管內于4℃下保存，有效期為1個月。
8.1.15氨基糖苷類藥物混合標準工作液(10μg/mL) 分別準確吸取1.0mL的鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素C1、卡那霉素、阿米卡星、大觀霉素、安普霉素和新霉素標準儲備液至100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻即得。配制完后轉移至塑料試管內于4℃下保存，有效期為1個月。
8.2儀器和設備
8.2.1 超高效液相色譜-串聯質譜儀(配電噴霧離子源)
8.2.2分析天平 感量0.00001g
8.2.3天平 感量0.01g
8.2.4渦旋混合器
8.2.5高速離心機
8.2.6 pH計
8.2.7固相萃取裝置
8.2.8 cBX固相萃取柱500mg/6mL，或相當者；
8.2.9氮吹儀
9、檢驗步驟
9.1試樣的制備
9.1.1 取均質的供試樣品，作為供試試料。
9.1.2取均質的空白樣品(2±0.02)g，作為空白試料(陰性對照)。
9.1.3 取均質的空白樣品(2±0.02)g，添加4μg/mL標準工作液0.1mL，作為空白添加試樣(陽性對照)。
9.2提取
9.2.1稱取(2±0.02)g試料，加10mmol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液(含0.4mmol/L ED-TA和2％三氯乙酸)8mL，渦旋混合后，中速振蕩提取5min，10000r/min離心10min，取上清液于另一50mL離心管內。
9.2.2重復提取一次，合并上清液；調其pH值至7.5～8.0，10000r/min離心10min，取上清液作為備用液。
9.3凈化
9.3.1 CBX小柱依次用甲醇、水各3mL活化。
9.3.2取全部備用液過柱，控制流速為1～3mL/min。
9.3.3用水5mL以同樣速度淋洗柱子，抽干。
9.3.4用10％乙酸甲醇溶液3mL洗脫于塑料試管內。
9.3.5洗脫液于400C下氮氣吹干。
殘余物加入5mmol/HFBA水溶液0.2mL，充分渦旋混勻；轉至1.5mL塑料離心管內，15000r/min離心10min，取適量上清液供超高效液相色譜一串聯質譜儀測定。
9.4測定
9.4.1色譜條件
9.4.1.1色譜柱：BEH C1850mm×2.1mm(i.d.)，粒徑1.7μm，或相當者；
9.4.1.2柱溫：300C；
9.4.1.3進樣量：10μL；
9.4.1.4流動相A：20mmol/L HFBA乙腈溶液；
流動相B：20mmol/L HFBA水溶液；
流動相梯度洗脫條件見表1。
9.4.2質譜條件
9.4.2.1離子源參考參數，見表2。
9.4.2.2質量分析器參考參數見表3。
9.4.2.3 光電倍增器電壓：650V
9.4.2.4 定性、定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量見表4。
參考資料：獸藥殘留檢測標準操作規程
