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高效液相色譜法實(shí)驗(yàn)技術(shù)
發(fā)布時(shí)間：2017-09-01
1、分離方式的選擇
高效液相色譜的分離方式非常多，對(duì)于一個(gè)欲分析的樣品要考慮的因素是：樣品的水溶性(脂溶性)、樣品分子的極性(非極性)、分子的結(jié)構(gòu)、相對(duì)分子質(zhì)量的大小等。綜合考慮被測(cè)樣品的物理化學(xué)性質(zhì)、特點(diǎn)之后可參照?qǐng)D10.3進(jìn)行選擇。
2、流動(dòng)相選擇與處理
高效液相色譜流動(dòng)相的選擇取決于分離方式，對(duì)于吸附色譜常用的是正己烷、正庚烷等非極性溶劑，分離時(shí)需加入少量的極性溶劑，如異丙醇、甲醇等。對(duì)于反相色譜最常用的是乙腈、甲醇、水等，有時(shí)需加入某種修飾劑。流動(dòng)相的選擇還必須與選擇的檢測(cè)器相匹配。當(dāng)選用紫外檢測(cè)器時(shí)，作為流動(dòng)相的溶劑中不能含有可能被檢測(cè)波長(zhǎng)吸收的雜質(zhì)(注意每種溶劑的紫外截止波長(zhǎng))。例如常用的乙腈(分析純)溶劑，常含有少量的丙酮、丙烯腈、丙烯醇和吧唑化合物，產(chǎn)生較大的背景吸收，用前必須采用活性炭或酸性氧化鋁吸附純化。
不論選用何種溶劑作流動(dòng)相，首先必須用O.45扯m的微孔濾膜過濾，以防不溶物磨損高壓泵和堵塞流路、色譜柱等。過濾后應(yīng)對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行脫氣處理，否則溶解在溶劑中的氣體形成的氣泡進(jìn)入檢測(cè)器后會(huì)引起尖銳的噪音峰，嚴(yán)重時(shí)影響系統(tǒng)的穩(wěn)定性，不能正常分析。常用的脫氣方式有超聲波振蕩法、He鼓泡置換法、在線真空脫氣法等。
3、流動(dòng)相洗脫方式
在高效液相色譜中流動(dòng)相有兩種洗脫方式。一種是等強(qiáng)度洗脫，即流動(dòng)相組成不隨分析時(shí)間變化，始終是均一的流動(dòng)相洗脫，這種方式適合于較簡(jiǎn)單的樣品分析。對(duì)于復(fù)雜的樣品需采用梯度洗脫的方式(類似于氣相色譜中程序升溫的作用)，即在分離過程中按設(shè)置的時(shí)間程序改變流動(dòng)相的組成，目的是逐漸增加流動(dòng)相的洗脫能力，使色譜柱中保留強(qiáng)度大的組分在流動(dòng)相中的溶解度增加，從而迅速流出色譜柱，縮短分析時(shí)間。梯度洗脫的方式可以是線性的或非線性的，可以是二元的或多元的，視欲分析的樣品而定。
4、衍生化技術(shù)
衍生化就是將用通常檢測(cè)方法不能直接檢測(cè)或檢測(cè)靈敏度低的物質(zhì)與某種試劑(衍生化試劑)反應(yīng)，使之生成易于檢測(cè)的化合物。按衍生化的方式可分柱前衍生和柱后衍生。柱前衍生是將被測(cè)物轉(zhuǎn)變成可檢測(cè)的衍生物后再通過色譜柱分離。這種衍生可以是在線衍生，即將被測(cè)物和衍生化試劑分別通過兩個(gè)輸液泵送到混合器里混合并使之立即反應(yīng)完成，隨之進(jìn)入色譜柱；也可以先將被測(cè)物和衍生化試劑反應(yīng)，再將衍生產(chǎn)物作為樣品進(jìn)樣；還可以在流動(dòng)相中加入衍生化試劑。柱后衍生是先將被測(cè)物分離，再將從色譜柱流出的溶液與反應(yīng)試劑在線混合生成可檢測(cè)的衍生物，然后導(dǎo)入檢測(cè)器。衍生化不僅使分析體系復(fù)雜化，而且需要消耗時(shí)間，因此，只有在找不到方便而靈敏的檢測(cè)方法或?yàn)榱颂岣叻蛛x和檢測(cè)的選擇性時(shí)才考慮用衍生化法。常見的紫外衍生化實(shí)例列于表10.2。
可見光衍生化主要應(yīng)用于過渡金屬離子的檢測(cè)，將過渡金屬離子與顯色劑反應(yīng)，生成有色的配合物、螯合物或離子締合物后用可見光檢測(cè)。
熒光衍生化是將被測(cè)物質(zhì)與熒光衍生化試劑反應(yīng)后生成具有熒光的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。常見的熒光衍生化實(shí)例列于表10.3。
電化學(xué)衍生法應(yīng)用較少，它是將無電活性的被測(cè)物與電活性衍生化試劑(其本身不一定具有電活性)反應(yīng)，生成可在電極上產(chǎn)生氧化或還原反應(yīng)的電活性衍生物。
參考資料：現(xiàn)代儀器分析實(shí)驗(yàn)與技術(shù)
