高效液相色譜法實驗技術
發布時間：2017-09-01
1、分離方式的選擇
高效液相色譜的分離方式非常多，對于一個欲分析的樣品要考慮的因素是：樣品的水溶性(脂溶性)、樣品分子的極性(非極性)、分子的結構、相對分子質量的大小等。綜合考慮被測樣品的物理化學性質、特點之后可參照圖10.3進行選擇。
2、流動相選擇與處理
高效液相色譜流動相的選擇取決于分離方式，對于吸附色譜常用的是正己烷、正庚烷等非極性溶劑，分離時需加入少量的極性溶劑，如異丙醇、甲醇等。對于反相色譜最常用的是乙腈、甲醇、水等，有時需加入某種修飾劑。流動相的選擇還必須與選擇的檢測器相匹配。當選用紫外檢測器時，作為流動相的溶劑中不能含有可能被檢測波長吸收的雜質(注意每種溶劑的紫外截止波長)。例如常用的乙腈(分析純)溶劑，常含有少量的丙酮、丙烯腈、丙烯醇和吧唑化合物，產生較大的背景吸收，用前必須采用活性炭或酸性氧化鋁吸附純化。
不論選用何種溶劑作流動相，首先必須用O.45扯m的微孔濾膜過濾，以防不溶物磨損高壓泵和堵塞流路、色譜柱等。過濾后應對流動相進行脫氣處理，否則溶解在溶劑中的氣體形成的氣泡進入檢測器后會引起尖銳的噪音峰，嚴重時影響系統的穩定性，不能正常分析。常用的脫氣方式有超聲波振蕩法、He鼓泡置換法、在線真空脫氣法等。
3、流動相洗脫方式
在高效液相色譜中流動相有兩種洗脫方式。一種是等強度洗脫，即流動相組成不隨分析時間變化，始終是均一的流動相洗脫，這種方式適合于較簡單的樣品分析。對于復雜的樣品需采用梯度洗脫的方式(類似于氣相色譜中程序升溫的作用)，即在分離過程中按設置的時間程序改變流動相的組成，目的是逐漸增加流動相的洗脫能力，使色譜柱中保留強度大的組分在流動相中的溶解度增加，從而迅速流出色譜柱，縮短分析時間。梯度洗脫的方式可以是線性的或非線性的，可以是二元的或多元的，視欲分析的樣品而定。
4、衍生化技術
衍生化就是將用通常檢測方法不能直接檢測或檢測靈敏度低的物質與某種試劑(衍生化試劑)反應，使之生成易于檢測的化合物。按衍生化的方式可分柱前衍生和柱后衍生。柱前衍生是將被測物轉變成可檢測的衍生物后再通過色譜柱分離。這種衍生可以是在線衍生，即將被測物和衍生化試劑分別通過兩個輸液泵送到混合器里混合并使之立即反應完成，隨之進入色譜柱；也可以先將被測物和衍生化試劑反應，再將衍生產物作為樣品進樣；還可以在流動相中加入衍生化試劑。柱后衍生是先將被測物分離，再將從色譜柱流出的溶液與反應試劑在線混合生成可檢測的衍生物，然后導入檢測器。衍生化不僅使分析體系復雜化，而且需要消耗時間，因此，只有在找不到方便而靈敏的檢測方法或為了提高分離和檢測的選擇性時才考慮用衍生化法。常見的紫外衍生化實例列于表10.2。
可見光衍生化主要應用于過渡金屬離子的檢測，將過渡金屬離子與顯色劑反應，生成有色的配合物、螯合物或離子締合物后用可見光檢測。
熒光衍生化是將被測物質與熒光衍生化試劑反應后生成具有熒光的物質進行檢測。常見的熒光衍生化實例列于表10.3。
電化學衍生法應用較少，它是將無電活性的被測物與電活性衍生化試劑(其本身不一定具有電活性)反應，生成可在電極上產生氧化或還原反應的電活性衍生物。
參考資料：現代儀器分析實驗與技術
