高效液相色譜法實驗
發布時間：2017-09-01
一、VE異構體在正相HPLC系統中分析條件的選擇
1、實驗目的
(1)了解HPLC儀器的基本結構和工作原理，學習儀器的基本操作。
(2)理解正相HPLC的特點和應用。
(3)學習選擇正相HPLC最佳分析條件的方法。
2、實驗原理
維生素E(VE)為苯丙二氫吡喃醇衍生物，因其在苯環上有一個酚羥基，故此類化合物又稱生育酚。VE主要有a，β，γ和δ4種異構體，其中以α-異構體的生理作用為最強，而抗氧化能力則以δ-異構體為最強。通常所說的VE是一個多種異構體混合物，有時可能以生育酚羧酸酯的形式存在。
正相HPLC通常也稱液一固色譜，它是以極性固體吸附劑為固定相，以弱極性或非極性溶劑為流動相組成的色譜體系，該體系中被分離的各組分在固定相表面的活性中心發生競爭吸附，由于吸附能力的不同，被流動相洗脫的速度不同，得到彼此的分離。另外，若組分分子構型與吸附劑表面活性中心的幾何構型相適應，則作用力較強者易被吸附，因此液一固色譜常用于分離各種類型的異構體。
分離效能與諸多因素有關，如吸附劑種類、比表面積、物化性質、組分分子的結構、流動相的性質與組成等。本實驗重點是流動相的選擇。
3、儀器與試劑
儀器：高效液相色譜儀：帶紫外檢測器；
超聲波發生器：用于樣品溶解，流動相脫氣，玻璃器皿清洗。
試劑：異丙醇、正己烷、無水乙醇(純度均為AR)；
混合維生素E：用50mL的燒杯稱取混合VE100～150mg，用無水乙醇溶解并定容至25mI。容量瓶，使用時用無水乙醇稀釋5～10倍；
α-VE標準溶液：準確稱量α-VE標樣，用無水乙醇配制，濃度約1000mg／L，使用時用無水乙醇或流動相溶液稀釋5～10倍。
4、實驗內容與步驟
(1)按儀器操作說明書規定的順序依次打開儀器各單元的電源。
(2)檢查色譜柱和流動相：本實驗采用硅膠柱(Micropak Si-5?4.6mm i.d.×150mm)，流動相為正己烷和異丙醇。
(3)設置1 00％正己烷為流動相，流速為1.0mL／min，色譜柱溫度為30℃，檢測波長為292nm(可經紫外-可見光光譜儀掃描確定)。
(4)檢查或排除流路中的氣泡，啟動輸液泵。
(5)待基線穩定后用六通閥注進混合VE樣品(注射器和六通閥用溶劑和樣品溶液沖洗數次，并注意不要吸入氣泡)。
(6)觀察VE異構體分離情況，記錄保留時間和半峰寬。
(7)將流動相換成正己烷／異丙醇混合溶劑(體積比99.5/O.5)，待基線穩定后，注進混合VE樣品，重復(6)的操作。
(8)將流動相換成正己烷/異丙醇混合溶劑(體積比98/2)，待基線穩定后，注進混合VE樣品，重復(6)的操作。
(9)比較(7)和(8)，找出最佳色譜條件，注入α-VE標樣，確認混合VE樣品中α-VE峰的位置。
(10)所有樣品分析完后，讓流動相繼續流動10～20min，然后停泵，關機并整理好實驗臺。
5、注意事項
(1)操作時一定要參照儀器的操作規程。
(2)開泵前應檢查流路中的氣泡，應確保排除干凈。
(3)色譜柱的個體差異很大，因此，色譜條件(主要是流動相配比)應根據所用色譜柱的實際情況作適當的調整。
(4)各異構體可依據結構的差異進行確認，也可用HPLC-MS確認。
6、數據處理
(1)將不同流動相組成下各色譜峰的保留時間、半峰寬、峰面積整理成表，并計算分離度。
(2)總結流動相中添加極性溶劑異丙醇對溶質保留行為的影響規律。
參考資料：現代儀器分析實驗與技術
