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高效液相色譜法-果汁(蘋果汁)中有機酸的分析
發布時間：2017-09-01
1、實驗目的
(1)了解HPLC在食品中的應用。
(2)理解緩沖溶液在流動相中的作用。
(3)掌握用內標法對組分進行定量分析的方法。
2、實驗原理
在食品中，主要的有機酸是乙酸、丁二酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸等，它們可能來自原料、發酵過程或是添加劑。這些有機酸在水溶液中有較大的解離度。在反相鍵合相色譜中易發生色譜峰拖尾現象。蘋果汁中的有機酸主要是蘋果酸和檸檬酸。在酸性流動相條件下(如pH 2～5)，上述有機酸的離解得到抑制，利用分子狀態的有機酸的疏水性，使其在C18鍵合相色譜柱中能夠保留。由于不同有機酸的疏水性不同，疏水性大的有機酸在固定相中保留強，較晚流出色譜柱，否則較早流出，從而使各組分得到分離。
內標法是色譜定量中常用的方法，該法適用于只需對樣品中某幾個組分進行定量的情況，定量比較準確，對進樣量和操作條件的穩定性要求不太苛刻。本實驗選擇酒石酸為內標物，只對蘋果汁中的蘋果酸和檸檬酸進行定量分析。
有機酸在波長210nm附近有較強的吸收，因此可采用紫外檢測器進行檢測。
3、儀器與試劑
儀器：高效液相色譜儀、紫外檢測器、脫氣裝置。
試劑：磷酸二氫銨(優級純)：配制8mmol／L的水溶液和2mmol／L水溶液；重蒸去離子水；
蘋果酸(優級純)：準確稱取一定量的蘋果酸，用重蒸水配制1000mg／L的溶液，使用時適當稀釋；
檸檬酸、酒石酸皆為優級純，配制水溶液(方法同蘋果酸)；
3種有機酸的混合標準溶液：各含約200mg／L；
蘋果汁：市售蘋果汁用0.45μm濾膜過濾后備用。
4、實驗內容與步驟
(1)參照儀器使用說明開機，排空流路中的氣泡。
(2)設置實驗參數：C18鍵和相色譜柱，流動相為0.8mmol／L和0.2mmol／L的磷酸二氫氨水溶液，比例為1／1(體積比)，流速為1.0mL／min，柱溫為30℃，紫外檢測波長為210nm，進樣量20μL。
(3)啟動色譜系統，待基線穩定后，注入3種有機酸的混合標樣，觀察分離情況。
(4)調整流動相的比例，使3種有機酸得到良好的分離。
(5)分別注入3種有機酸的標樣，根據保留值進行定性。
(6)注入有機酸混合標樣，重復3次(峰面積誤差小于3％)，用于計算各自的校正因子。
(7)注入待測蘋果汁的樣品，重復3次(峰面積誤差在3％之內)。
(8)準確稱量一定量的內標物酒石酸樣品，加入到準確稱量的待測蘋果汁樣品中，記錄各自的稱量值，搖勻待用。
(9)注入含有內標物的待測蘋果汁樣品，重復3次(峰面積誤差在3％之內)。
(10)按關機程序關機。
5、注意事項
(1)配制樣品時，稱量一定要準確。
(2)實驗結束后以純水為流動相，沖洗色譜柱，以避免柱的堵塞。
6、數據處理
(1)計算3種有機酸的校正因子和分離度。
(2)按外標法計算蘋果汁中蘋果酸和檸檬酸的含量。
(3)以酒石酸為內標物，按內標法計算蘋果汁中蘋果酸和檸檬酸的含量，與 (2)的結果進行比較，并加以討論。
參考資料：現代儀器分析實驗與技術
