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常用毒理學(xué)試驗(yàn)方法（二）
發(fā)布時(shí)間：2017-09-01
(二)急性非致死毒性試驗(yàn)
急性非致死毒性試驗(yàn)可用來(lái)測(cè)定常見的非致死毒性的安全界限，也可為急性中毒的危險(xiǎn)性評(píng)估提供依據(jù)。一些測(cè)定受試物刺激作用的方法如下。
1、急性閾劑量(濃度)的測(cè)定
可根據(jù)受試物對(duì)機(jī)體作用的性質(zhì)、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮途唧w條件，選擇合適的、靈敏的觀察指標(biāo)。例如對(duì)于刺激性氣體，可測(cè)定其刺激閾濃度或感官閾濃度。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多選用健康貓數(shù)只，置于含有受試物的染毒柜內(nèi)，染毒30min。觀察并測(cè)得剛引起30 %動(dòng)物出現(xiàn)輕微刺激癥狀(流淚、流涕、流涎等)的濃度作為閾濃度。
2、局部刺激試驗(yàn)
許多化學(xué)物可引起接觸的皮膚和黏膜損傷，常采用皮膚和眼結(jié)膜刺激試驗(yàn)來(lái)評(píng)定其毒性作用。
(1)急性皮膚刺激試驗(yàn)選用健康成年家兔或豚鼠，不少于4只。按皮膚染毒法去毛，取受試物0.1mL或0.5mL(固態(tài)受試物用水或賦形劑調(diào)制)，涂于一側(cè)皮膚上，另一側(cè)涂賦形劑作對(duì)照，敷用lh或24h。去除受試物后lh、24h、48h和72h觀察涂抹部位反應(yīng)，按皮膚刺激反應(yīng)積分評(píng)定刺激強(qiáng)度。
(2)急性眼刺激試驗(yàn)將液態(tài)或軟膏受試物(O.1mL或100mg)滴入或涂入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一側(cè)結(jié)膜囊內(nèi)，另一側(cè)眼作為對(duì)照。于6h、24h、48h和72h后觀察局部反應(yīng)，第4天、第7天觀察恢復(fù)情況，觀察時(shí)可用熒光素鈉檢查角膜損害。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)可參考我國(guó)《化妝品安全性評(píng)價(jià)程序和方法》及有關(guān)資料。
二、蓄積性和耐受性試驗(yàn)
蓄積作用是環(huán)境化學(xué)物慢性中毒的基礎(chǔ)。大多數(shù)外來(lái)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后，經(jīng)過(guò)復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化和生物轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，最后將由體內(nèi)消除。如果一種外來(lái)化學(xué)物質(zhì)反復(fù)多次進(jìn)人機(jī)體而
且其前次進(jìn)入劑量尚未完全消除，后一次劑量又已經(jīng)進(jìn)入，則這一化學(xué)物質(zhì)在體內(nèi)的總量將不斷增加，此種性質(zhì)稱為蓄積性。將一種有毒化學(xué)物質(zhì)以較小劑量按一定時(shí)間間隔反復(fù)多次輸入體內(nèi)，如果此種有毒物質(zhì)每次在體內(nèi)可以蓄積一定數(shù)量，當(dāng)蓄積的總量超過(guò)其中毒閾劑量時(shí)，機(jī)體可呈現(xiàn)毒性反應(yīng)或死亡。
化學(xué)物質(zhì)在體內(nèi)的蓄積包括兩層含義，當(dāng)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后，在體內(nèi)消除的數(shù)量少于輸入的數(shù)量，以致其在體內(nèi)儲(chǔ)留的量逐漸增加，此種量的蓄積也可理解為物質(zhì)的蓄積。另一層含義是化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后將引起機(jī)體的功能或結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生一定程度的改變，如果是一種不可逆的變化，或在機(jī)體修復(fù)過(guò)程尚未完成前，化學(xué)物質(zhì)第二次又已進(jìn)入機(jī)體，并再次造成損害，則這種功能或形態(tài)變化也可逐漸積累，也就是功能蓄積。
(一)蓄積性試驗(yàn)
環(huán)境化學(xué)物蓄積性試驗(yàn)可采用蓄積系數(shù)法或20天試驗(yàn)法進(jìn)行。
1、蓄積系數(shù)法
將某種化學(xué)物質(zhì)按一定時(shí)間間隔，分次給予動(dòng)物，經(jīng)過(guò)一定期間的反復(fù)多次給予后，如果該物質(zhì)全部在體內(nèi)蓄積，則多次給予的總劑量與一次給予同等劑量的毒性相當(dāng)；反之，如該化學(xué)物質(zhì)在體內(nèi)僅有一部分蓄積，則分次給予總量的毒性作用與一次給予同等劑量的毒性作用將有一定程度的差別，而且蓄積性越小，相差程度越大。因此，可將能夠達(dá)到同一效應(yīng)(LD50)分次給予所需的總劑量[以LD50(n)表示]與一次給予所需的劑量之比，來(lái)表示一種化學(xué)物質(zhì)蓄積性的大小，即K=LD50(n)，／LD50(1)。
K值越大，蓄積性越弱；反之，K值越小，蓄積性越強(qiáng)。一般可根據(jù)K值對(duì)蓄積性進(jìn)行估計(jì)：1≤K＜3表示強(qiáng)蓄積；3≤K＜5表示中等蓄積；K≥5表示輕度蓄積。
2、二十天試驗(yàn)法
給藥共20天，試驗(yàn)動(dòng)物可采用成年大鼠(體重200g左右)，每組10只，要求雌雄分別同時(shí)進(jìn)行，共5組。各組受試物劑量分別為L(zhǎng)D50的1/20、1/10、1/5、1/2，另設(shè)對(duì)照組。每天灌胃一次，連續(xù)20天。各組累積總劑量可達(dá)1LD50、2LD50、4LD50、10LD50，觀察7天。
如蓄積系數(shù)K小于3，為強(qiáng)蓄積性；K大于或等于3，為弱蓄積性。20天試驗(yàn)法如1／20LD50組動(dòng)物有死亡，且有劑量一效應(yīng)關(guān)系，則為強(qiáng)蓄積性；如1／20 LD50組動(dòng)物無(wú)死亡，則為弱蓄積性。強(qiáng)蓄積性者放棄。
(二)耐受性試驗(yàn)
耐受性是機(jī)體多次接觸化學(xué)物質(zhì)后，對(duì)該物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)性減弱的現(xiàn)象，顯示不易發(fā)生慢性中毒。對(duì)動(dòng)物耐受性的觀察多在蓄積性試驗(yàn)結(jié)束后，如果劑量已遠(yuǎn)超過(guò)5個(gè)LD50，死亡動(dòng)物未超過(guò)半數(shù)，說(shuō)明該物質(zhì)蓄積性很低外，也可能機(jī)體已產(chǎn)生耐受性。為此，可對(duì)尚存活的動(dòng)物給予一個(gè)LD50的打擊劑量，并觀察動(dòng)物死亡情況，如死亡率明顯低于對(duì)照組，表示已產(chǎn)生耐受性。
三、亞急性和亞慢性毒性試驗(yàn)
亞急性和亞慢性毒性試驗(yàn)是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)多日接觸較大劑量(小于急性LD50的劑量)的外來(lái)化學(xué)物所出現(xiàn)的中毒效應(yīng)。染毒期一般為1～6個(gè)月，有的研究者采用更短的時(shí)間，2周至一個(gè)月，稱為亞急性試驗(yàn)，染毒3～6個(gè)月的稱亞慢性試驗(yàn)。亞急性或亞慢性試驗(yàn)的目的是在急性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在較短時(shí)間內(nèi)了解受試物對(duì)機(jī)體的主要毒性作用及其靶器官，探討敏感的觀測(cè)指標(biāo)和劑量一效應(yīng)關(guān)系，為慢性毒性試驗(yàn)提供依據(jù)。
1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)是急性毒性試驗(yàn)已經(jīng)證明對(duì)受試物敏感的種類和品系。常選用兩種以上的動(dòng)物，所選用的動(dòng)物對(duì)受試物的生物轉(zhuǎn)化方式與人基本相同。一般首選大鼠，每組10～20只，兔、狗等較大動(dòng)物，每組不應(yīng)少于4只，雌雄各半。
2、實(shí)驗(yàn)期限
亞急性和亞慢性毒性試驗(yàn)的期限至今尚無(wú)完全統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。制定時(shí)應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛣?dòng)物種類而定，一般為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物壽命的10％左右。有的學(xué)者主張進(jìn)行慢性毒性試驗(yàn)時(shí)，將受試物混合于飼料或飲水中，動(dòng)物自由攝取連續(xù)90天。也主張呼吸接觸可進(jìn)行30天或90天試驗(yàn)，每天6h，每周5天。經(jīng)皮膚接觸進(jìn)行30天試驗(yàn)。在測(cè)試期內(nèi)，要求每天的染毒劑量相等。
3、劑量分組
在亞急性或亞慢性試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，染毒劑量選擇是否恰當(dāng)是試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。一般設(shè)3～4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組。最高劑量可選用1／20～I(xiàn)／5LD50。對(duì)于在體內(nèi)不產(chǎn)生蓄積作用而排泄又快的物質(zhì)可適當(dāng)加大劑量，反之則可減少劑量。一般要求在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，最低劑量組的動(dòng)物不會(huì)產(chǎn)生可觀察到的毒性反應(yīng)，相當(dāng)于亞慢性的最大無(wú)作用劑量；中間劑量組應(yīng)產(chǎn)生輕微的毒性反應(yīng)，相當(dāng)于亞慢性毒性的閾劑量；最高劑量組要求能引起動(dòng)物明顯的毒性反應(yīng)，但又不引起動(dòng)物死亡。相鄰組距可根據(jù)死亡劑量一效應(yīng)曲線和蓄積系數(shù)，選擇3～10倍的比例。蓄積性強(qiáng)的化學(xué)物，組距要大些，反之要小。
4、染毒途徑
染毒途徑的選擇既要與人類實(shí)際接觸的途徑或方式盡可能一致，又要與預(yù)期進(jìn)行的慢性毒性試驗(yàn)的接觸途徑相一致。對(duì)氣體和揮發(fā)性物質(zhì)可采用呼吸道吸入染毒。農(nóng)藥、重金屬及各種能污染水和食物的化學(xué)物，應(yīng)采用經(jīng)口染毒，可采用喂飼法或灌胃法，也可將化學(xué)物混入水中，讓動(dòng)物自由飲用。對(duì)于有氣味、揮發(fā)性或刺激性的物質(zhì)應(yīng)采用灌胃法。試驗(yàn)期間，每天應(yīng)定時(shí)染毒，以維持試驗(yàn)動(dòng)物血液(體液)中受試物濃度穩(wěn)定，以保持每天相似的毒性效應(yīng)。
參考資料：環(huán)境中有毒有害物質(zhì)與分析檢測(cè)
