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常用毒理學試驗方法（二）
發(fā)布時間：2017-09-01
(二)急性非致死毒性試驗
急性非致死毒性試驗可用來測定常見的非致死毒性的安全界限，也可為急性中毒的危險性評估提供依據(jù)。一些測定受試物刺激作用的方法如下。
1、急性閾劑量(濃度)的測定
可根據(jù)受試物對機體作用的性質(zhì)、實驗?zāi)康暮途唧w條件，選擇合適的、靈敏的觀察指標。例如對于刺激性氣體，可測定其刺激閾濃度或感官閾濃度。實驗動物多選用健康貓數(shù)只，置于含有受試物的染毒柜內(nèi)，染毒30min。觀察并測得剛引起30 %動物出現(xiàn)輕微刺激癥狀(流淚、流涕、流涎等)的濃度作為閾濃度。
2、局部刺激試驗
許多化學物可引起接觸的皮膚和黏膜損傷，常采用皮膚和眼結(jié)膜刺激試驗來評定其毒性作用。
(1)急性皮膚刺激試驗選用健康成年家兔或豚鼠，不少于4只。按皮膚染毒法去毛，取受試物0.1mL或0.5mL(固態(tài)受試物用水或賦形劑調(diào)制)，涂于一側(cè)皮膚上，另一側(cè)涂賦形劑作對照，敷用lh或24h。去除受試物后lh、24h、48h和72h觀察涂抹部位反應(yīng)，按皮膚刺激反應(yīng)積分評定刺激強度。
(2)急性眼刺激試驗將液態(tài)或軟膏受試物(O.1mL或100mg)滴入或涂入實驗動物一側(cè)結(jié)膜囊內(nèi)，另一側(cè)眼作為對照。于6h、24h、48h和72h后觀察局部反應(yīng)，第4天、第7天觀察恢復情況，觀察時可用熒光素鈉檢查角膜損害。評定標準可參考我國《化妝品安全性評價程序和方法》及有關(guān)資料。
二、蓄積性和耐受性試驗
蓄積作用是環(huán)境化學物慢性中毒的基礎(chǔ)。大多數(shù)外來化學物質(zhì)進入機體后，經(jīng)過復雜的生物轉(zhuǎn)化和生物轉(zhuǎn)運過程，最后將由體內(nèi)消除。如果一種外來化學物質(zhì)反復多次進人機體而
且其前次進入劑量尚未完全消除，后一次劑量又已經(jīng)進入，則這一化學物質(zhì)在體內(nèi)的總量將不斷增加，此種性質(zhì)稱為蓄積性。將一種有毒化學物質(zhì)以較小劑量按一定時間間隔反復多次輸入體內(nèi)，如果此種有毒物質(zhì)每次在體內(nèi)可以蓄積一定數(shù)量，當蓄積的總量超過其中毒閾劑量時，機體可呈現(xiàn)毒性反應(yīng)或死亡。
化學物質(zhì)在體內(nèi)的蓄積包括兩層含義，當化學物質(zhì)進入機體后，在體內(nèi)消除的數(shù)量少于輸入的數(shù)量，以致其在體內(nèi)儲留的量逐漸增加，此種量的蓄積也可理解為物質(zhì)的蓄積。另一層含義是化學物質(zhì)進入機體后將引起機體的功能或結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生一定程度的改變，如果是一種不可逆的變化，或在機體修復過程尚未完成前，化學物質(zhì)第二次又已進入機體，并再次造成損害，則這種功能或形態(tài)變化也可逐漸積累，也就是功能蓄積。
(一)蓄積性試驗
環(huán)境化學物蓄積性試驗可采用蓄積系數(shù)法或20天試驗法進行。
1、蓄積系數(shù)法
將某種化學物質(zhì)按一定時間間隔，分次給予動物，經(jīng)過一定期間的反復多次給予后，如果該物質(zhì)全部在體內(nèi)蓄積，則多次給予的總劑量與一次給予同等劑量的毒性相當；反之，如該化學物質(zhì)在體內(nèi)僅有一部分蓄積，則分次給予總量的毒性作用與一次給予同等劑量的毒性作用將有一定程度的差別，而且蓄積性越小，相差程度越大。因此，可將能夠達到同一效應(yīng)(LD50)分次給予所需的總劑量[以LD50(n)表示]與一次給予所需的劑量之比，來表示一種化學物質(zhì)蓄積性的大小，即K=LD50(n)，／LD50(1)。
K值越大，蓄積性越弱；反之，K值越小，蓄積性越強。一般可根據(jù)K值對蓄積性進行估計：1≤K＜3表示強蓄積；3≤K＜5表示中等蓄積；K≥5表示輕度蓄積。
2、二十天試驗法
給藥共20天，試驗動物可采用成年大鼠(體重200g左右)，每組10只，要求雌雄分別同時進行，共5組。各組受試物劑量分別為LD50的1/20、1/10、1/5、1/2，另設(shè)對照組。每天灌胃一次，連續(xù)20天。各組累積總劑量可達1LD50、2LD50、4LD50、10LD50，觀察7天。
如蓄積系數(shù)K小于3，為強蓄積性；K大于或等于3，為弱蓄積性。20天試驗法如1／20LD50組動物有死亡，且有劑量一效應(yīng)關(guān)系，則為強蓄積性；如1／20 LD50組動物無死亡，則為弱蓄積性。強蓄積性者放棄。
(二)耐受性試驗
耐受性是機體多次接觸化學物質(zhì)后，對該物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)性減弱的現(xiàn)象，顯示不易發(fā)生慢性中毒。對動物耐受性的觀察多在蓄積性試驗結(jié)束后，如果劑量已遠超過5個LD50，死亡動物未超過半數(shù)，說明該物質(zhì)蓄積性很低外，也可能機體已產(chǎn)生耐受性。為此，可對尚存活的動物給予一個LD50的打擊劑量，并觀察動物死亡情況，如死亡率明顯低于對照組，表示已產(chǎn)生耐受性。
三、亞急性和亞慢性毒性試驗
亞急性和亞慢性毒性試驗是指實驗動物連續(xù)多日接觸較大劑量(小于急性LD50的劑量)的外來化學物所出現(xiàn)的中毒效應(yīng)。染毒期一般為1～6個月，有的研究者采用更短的時間，2周至一個月，稱為亞急性試驗，染毒3～6個月的稱亞慢性試驗。亞急性或亞慢性試驗的目的是在急性試驗的基礎(chǔ)上，在較短時間內(nèi)了解受試物對機體的主要毒性作用及其靶器官，探討敏感的觀測指標和劑量一效應(yīng)關(guān)系，為慢性毒性試驗提供依據(jù)。
1、實驗動物
所用實驗動物應(yīng)是急性毒性試驗已經(jīng)證明對受試物敏感的種類和品系。常選用兩種以上的動物，所選用的動物對受試物的生物轉(zhuǎn)化方式與人基本相同。一般首選大鼠，每組10～20只，兔、狗等較大動物，每組不應(yīng)少于4只，雌雄各半。
2、實驗期限
亞急性和亞慢性毒性試驗的期限至今尚無完全統(tǒng)一的認識。制定時應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康暮蛣游锓N類而定，一般為實驗動物壽命的10％左右。有的學者主張進行慢性毒性試驗時，將受試物混合于飼料或飲水中，動物自由攝取連續(xù)90天。也主張呼吸接觸可進行30天或90天試驗，每天6h，每周5天。經(jīng)皮膚接觸進行30天試驗。在測試期內(nèi)，要求每天的染毒劑量相等。
3、劑量分組
在亞急性或亞慢性試驗設(shè)計中，染毒劑量選擇是否恰當是試驗成敗的關(guān)鍵。一般設(shè)3～4個實驗組和一個對照組。最高劑量可選用1／20～I／5LD50。對于在體內(nèi)不產(chǎn)生蓄積作用而排泄又快的物質(zhì)可適當加大劑量，反之則可減少劑量。一般要求在實驗結(jié)束時，最低劑量組的動物不會產(chǎn)生可觀察到的毒性反應(yīng)，相當于亞慢性的最大無作用劑量；中間劑量組應(yīng)產(chǎn)生輕微的毒性反應(yīng)，相當于亞慢性毒性的閾劑量；最高劑量組要求能引起動物明顯的毒性反應(yīng)，但又不引起動物死亡。相鄰組距可根據(jù)死亡劑量一效應(yīng)曲線和蓄積系數(shù)，選擇3～10倍的比例。蓄積性強的化學物，組距要大些，反之要小。
4、染毒途徑
染毒途徑的選擇既要與人類實際接觸的途徑或方式盡可能一致，又要與預(yù)期進行的慢性毒性試驗的接觸途徑相一致。對氣體和揮發(fā)性物質(zhì)可采用呼吸道吸入染毒。農(nóng)藥、重金屬及各種能污染水和食物的化學物，應(yīng)采用經(jīng)口染毒，可采用喂飼法或灌胃法，也可將化學物混入水中，讓動物自由飲用。對于有氣味、揮發(fā)性或刺激性的物質(zhì)應(yīng)采用灌胃法。試驗期間，每天應(yīng)定時染毒，以維持試驗動物血液(體液)中受試物濃度穩(wěn)定，以保持每天相似的毒性效應(yīng)。
參考資料：環(huán)境中有毒有害物質(zhì)與分析檢測
