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常用毒理學(xué)試驗(yàn)方法（三）
發(fā)布時(shí)間：2017-09-01
5、觀察指標(biāo)
除了血、尿常規(guī)，肝、腎功能及病理組織學(xué)檢查應(yīng)列為常規(guī)檢查外。還應(yīng)根據(jù)受試物的毒作用特點(diǎn)，選用其他最敏感的指標(biāo)。
(1)一般性指標(biāo)如動(dòng)物體重增長(zhǎng)率、食物消耗率、活動(dòng)能力等，這些指標(biāo)的變化是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)化學(xué)物毒性的整體反應(yīng)。體重明顯下降常常是中毒或疾病的信號(hào)，也是一項(xiàng)比較敏感的毒性反應(yīng)指標(biāo)。
(2)特異性指標(biāo)用以測(cè)定化學(xué)物作用于機(jī)體后所引起的特異性反應(yīng)，也有助于取得中毒機(jī)理的線索。它能更確切地闡明受試物對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生有害影響的閾劑量(濃度)及無作用劑量(濃度)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)盡量選用特異性指標(biāo)。比如用有機(jī)磷農(nóng)藥染毒時(shí)可測(cè)定血中膽堿酯酶活性；芳香族硝基化學(xué)物染毒可測(cè)定高鐵血紅蛋白；無機(jī)氟染毒可檢查斑釉發(fā)生率及牙齒和骨氟含量。
(3)一般化驗(yàn)指標(biāo)主要檢查血常規(guī)和肝、腎功能。通常血常規(guī)檢查的項(xiàng)目有紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類、血紅蛋白定量等。另外，還應(yīng)根據(jù)化學(xué)物毒作用特點(diǎn)進(jìn)行特殊項(xiàng)目的檢查。如鉛中毒時(shí)檢查點(diǎn)彩紅細(xì)胞，必要時(shí)可檢查骨髓細(xì)胞成分。肝功能檢查常用的有谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(COT)、堿性磷酸酶(AKP)、乳酸脫氫酶(LDH)及其同功酶等活性測(cè)定。腎功能檢查可進(jìn)行尿谷草轉(zhuǎn)氨酶含量測(cè)定、血清尿素氮測(cè)定、尿蛋白定性或定量、尿沉渣檢查等。
(4)有害物質(zhì)的代謝動(dòng)力學(xué)指標(biāo)為了明確汞、鎘、鉛、砷、氟等有害物質(zhì)在體內(nèi)的分布及排泄情況，為流行病學(xué)調(diào)查提供診斷依據(jù)，常常需要對(duì)血、尿、毛發(fā)等生物材料中相應(yīng)有害物質(zhì)的含量進(jìn)行測(cè)定。也可以測(cè)定化學(xué)物的代謝產(chǎn)物，如氰化物和有機(jī)腈化物經(jīng)代謝后，大部分以硫氰酸鹽的形式從尿中排出。
(5)病理組織學(xué)檢查凡是在染毒過程中死亡的動(dòng)物均應(yīng)及時(shí)解剖，以排除其他致死原因。肉眼檢查后再進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，必要時(shí)進(jìn)行組織化學(xué)或電鏡檢查。病理組織學(xué)檢查應(yīng)特別注意靶器官的變化，但肝、腎等組織應(yīng)列為常規(guī)檢查項(xiàng)目，同時(shí)應(yīng)對(duì)所見的病變程度作出定量分類，以便統(tǒng)計(jì)分析。臟器系數(shù)常常是一項(xiàng)比較靈敏的毒理學(xué)指標(biāo)。
臟器系數(shù)=內(nèi)臟質(zhì)量(g)／體重(g)
臟器系數(shù)常能反映中毒引起的病變情況。臟器系數(shù)減小，表示臟器發(fā)生萎縮、退行性變化；臟器系數(shù)增大，則可能是充血、水腫、增生肥大性變化等。
四、慢性毒性試驗(yàn)
慢性毒性試驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生命周期中的關(guān)鍵時(shí)期，用適當(dāng)?shù)姆椒ê蛣┝拷o動(dòng)物染毒后，觀察其累計(jì)的毒性效應(yīng)，有時(shí)可包括幾代的試驗(yàn)。主要目的是評(píng)價(jià)化學(xué)物在長(zhǎng)期小劑量作用的條件下對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的損害及其特點(diǎn)，確定慢性毒性作用閾劑量和最大無作用劑量，為制定環(huán)境中有害物質(zhì)的最高容許濃度(MAC)提供依據(jù)。
1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
常選用初斷乳的大鼠和小鼠或家兔和狗。大鼠應(yīng)選擇出生后3～4周，體重50～70g者；小鼠應(yīng)選擇出生后3周，體重10～12g者。每組染毒動(dòng)物的數(shù)量目前還元統(tǒng)一看法，可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的要求確定，一般大鼠每組20～40只，家兔6～10只，狗4～6只，每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌雄各半。
2、染毒期限
染毒期限一般要求1年以上或2年。也有學(xué)者主張動(dòng)物采用終生染毒，認(rèn)為終生染毒所求得的閾劑量與無作用劑量更能全面反映外源化學(xué)物的慢性毒性作用。但有人分析了一些毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)資料后認(rèn)為：毒物所致的病理改變大部分在6個(gè)月以內(nèi)出現(xiàn)，以后所增加的病理變化為數(shù)甚少。所以一般毒性試驗(yàn)不需把染毒期限定得太長(zhǎng)。大鼠、家兔一般為6個(gè)月，狗6～12個(gè)月。但對(duì)一些有明顯蓄積作用的化學(xué)物，或擬采用慢性毒性與致癌性聯(lián)合試驗(yàn)，則應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)試驗(yàn)期限，大鼠應(yīng)進(jìn)行2年。目前在進(jìn)行環(huán)境毒理學(xué)研究時(shí)，其他一些國家推薦用90天試驗(yàn)代替慢性毒性試驗(yàn)。
3、劑量分組
原則與亞慢性試驗(yàn)相同，一般設(shè)3～4個(gè)劑量組和一個(gè)對(duì)照組，必要時(shí)再加一個(gè)受試物的溶劑對(duì)照組。因染毒時(shí)間長(zhǎng)，確定劑量時(shí)應(yīng)十分慎重，可根據(jù)亞慢性試驗(yàn)資料，取其最低引起中毒反應(yīng)劑量的1/10、1/20及1/50或LD50的1/1000、1/lOO、1/lO作為慢性實(shí)驗(yàn)的劑量。最大劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)有輕微可見的毒性反應(yīng)或某些化驗(yàn)指標(biāo)明確而輕微的改變；最低劑量組應(yīng)是閾劑量組或無作用劑量組，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定。
4、染毒方式和觀察指標(biāo)的選擇
原則同亞慢性毒性試驗(yàn)，盡量選擇在亞慢性試驗(yàn)中找到的特異性和敏感性指標(biāo)。
遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)的首要目的是確定被檢化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)供試生物發(fā)生突變的可能性。以致突變?cè)囼?yàn)來定性表明受試物是否具有致突變作用或潛在的致癌作用。遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)的組合必須考慮原核細(xì)胞和真核細(xì)胞、生殖細(xì)胞和體細(xì)胞、體內(nèi)與體外試驗(yàn)相結(jié)合的原則。到目前為止，遺傳毒理學(xué)已發(fā)展_出上百種試驗(yàn)系統(tǒng)，在此僅就幾種常見的試驗(yàn)方法作一簡(jiǎn)要介紹。
(一)目的
致突變?cè)囼?yàn)的目的是對(duì)受試物是否具有致癌作用的可能性進(jìn)行篩選。
致突變?cè)囼?yàn)是遺傳毒理學(xué)的主要內(nèi)容。近年來愈來愈多的結(jié)果說明，致癌劑往往就是致突變物質(zhì)，而致突變物質(zhì)也往往具有致癌作用。兩者的相關(guān)是十分密切的，當(dāng)然也有已知致癌劑卻不具有致突變作用，這可能與其他不涉及DNA的致癌機(jī)制有關(guān)。
致突變?cè)囼?yàn)是檢驗(yàn)外來化學(xué)物質(zhì)有無引起突變作用的試驗(yàn)。突變是生物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)出現(xiàn)了可被覺察并可以遺傳的變化。能引起生物細(xì)胞發(fā)生突變的物質(zhì)稱為致突變物。突變可以分為基因突變和染色體畸變。基因突變是指染色體上一個(gè)基因或幾個(gè)基因發(fā)生變化，不能用光學(xué)顯微鏡直接觀察到，需要用其他理化或生物學(xué)方法才能檢出。染色體畸變是指整個(gè)染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目發(fā)生了變化，用光學(xué)顯微鏡可以直接觀察到。
突變可通過生殖細(xì)胞傳給后代，引起遺傳性疾病，也可通過體細(xì)胞在接觸誘變物的個(gè)體上表現(xiàn)出來，通常認(rèn)為這可能是癌癥的原因。在毒理學(xué)試驗(yàn)中，如果受試物可引起人或動(dòng)物基因突變或染色體畸變，則應(yīng)該禁止應(yīng)用于食品中。
(二)試驗(yàn)項(xiàng)目
致突變?cè)囼?yàn)的基本原理是將受試物與一種生物系統(tǒng)相接觸，然后觀察該生物系統(tǒng)是否發(fā)生突變。凡能使生物系統(tǒng)發(fā)生突變者，即為致突變物。致突變?cè)囼?yàn)中所用的生物系統(tǒng)包括細(xì)菌、真菌、昆蟲、細(xì)胞株和哺乳動(dòng)物等。
1、Ames試驗(yàn)
Ames試驗(yàn)即微粒體間接法，亦稱為鼠傷寒沙門菌／哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)法。
Ames法基本原理是以一種突變型微生物與受試化學(xué)物質(zhì)接觸，并以哺乳動(dòng)物肝微粒體進(jìn)行受試化學(xué)物質(zhì)的代謝活化，因?yàn)橥鈦砘瘜W(xué)物質(zhì)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化主要是由肝微粒體的混合功能氧化酶來進(jìn)行。若受試物經(jīng)多功能氧化酶代謝活化后具有致突變性，則可使突變型微生物發(fā)生回復(fù)突變而重新成為野生型微生物。
突變型微生物的來源是將野生型微生物用物理或化學(xué)方法使其發(fā)生突變，成為突變型。Ames試驗(yàn)所用指示微生物為組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門菌的幾個(gè)特殊菌株，即TAl535、TAl536、TAl537、TAl538、TA98和TAl00。這一組突變菌株幾乎可以檢出所有已知的基因突變類型。
參考資料：環(huán)境中有毒有害物質(zhì)與分析檢測(cè)
