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常用毒理學(xué)試驗(yàn)方法（五）
發(fā)布時(shí)間：2017-09-01
二、繁殖試驗(yàn)
繁殖試驗(yàn)是檢查受試物對(duì)動(dòng)物繁殖生育功能影響的試驗(yàn)。
(1)試驗(yàn)?zāi)康?通過進(jìn)行繁殖試驗(yàn)，以確定動(dòng)物攝人受試物后是否仍能正常交配受孕、能否保證胚胎正常發(fā)育、分娩過程是否順利以及后代出生后能否正常發(fā)育成長。
生殖系統(tǒng)對(duì)外界環(huán)境因素的作用非常敏感。外來化學(xué)物質(zhì)可以引起生殖細(xì)胞損傷從而影響生殖過程，胚胎、胎兒和新生動(dòng)物對(duì)外來化學(xué)物質(zhì)也常常表現(xiàn)很敏感。
(2)試驗(yàn)動(dòng)物多用斷乳大鼠，也可采用小鼠、家兔等。
(3)劑量分組高劑量組可相當(dāng)于90天毒性試驗(yàn)中的最大無作用劑量。低劑量組可為高劑量組的若干分之一。同時(shí)要設(shè)置對(duì)照組。
(4)觀察指標(biāo)主要觀察以下四個(gè)指標(biāo)，分別反映動(dòng)物交配受孕、妊娠過程、分娩過程和哺育幼仔成活情況。
如果仔鼠在出生后4天內(nèi)死亡，則可能由于分娩過程發(fā)生障礙，損傷幼仔所致。如在出生后21天內(nèi)仔鼠死亡，則表示母鼠哺育能力發(fā)生障礙。
除上述各項(xiàng)指標(biāo)外，還可觀察仔鼠生長發(fā)育情況和一般健康狀況，記錄進(jìn)食量、死亡率，并計(jì)算飼料效價(jià)。飼養(yǎng)3個(gè)月后，還可觀察性成熟情況。仔鼠出生時(shí)和斷奶時(shí)的體重、身長和尾長可作為生長發(fā)育的指標(biāo)。
三、致畸試驗(yàn)
某些化學(xué)物質(zhì)，可通過妊娠母體干擾正常的胚胎發(fā)育而引起胚胎畸形。目前已知與環(huán)境有關(guān)的致畸物有四氯二苯并二嘿英、敵枯雙、五氯酚(鈉)、滴滴涕、氯丹、黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A等。大量維生素A也有致畸作用。
(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用受孕雌性大鼠、小鼠和家兔等，有條件時(shí)也可用狗和猴進(jìn)行試驗(yàn)。具體試驗(yàn)中最好選用大鼠，因其具有自然畸胎率低、胎仔大小適中便于檢查、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
(2)受試物劑量可根據(jù)目的和方法來確定。如果只是定性檢查被檢物有無致畸作用，組數(shù)可少些，每組動(dòng)物數(shù)應(yīng)較多，劑量應(yīng)較高。如果試驗(yàn)期間只給予受試物一次，則劑量應(yīng)較高，多次給予時(shí)劑量應(yīng)較低。一般情況下，高劑量與低劑量之間可適當(dāng)插入1～3個(gè)至4～5個(gè)中間劑量組。每組動(dòng)物數(shù)大鼠、小鼠應(yīng)不少于10～20只。同時(shí)還要設(shè)置陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組。陽性對(duì)照組動(dòng)物要給予已知的致畸物，例如敵枯雙、五氯酚等。
(3)試驗(yàn)步驟將選定的大鼠或小鼠按雌雄2∶1進(jìn)行同籠交配，并準(zhǔn)確掌握其受精日期。對(duì)每只孕鼠應(yīng)準(zhǔn)確記錄受精日期、給予被檢物日期和劑量。每2～3天稱體重一次，并調(diào)整劑量，也可對(duì)孕鼠及胚胎受被檢物影響的程度作出估計(jì)。如孕鼠的胚胎發(fā)育正常，則孕鼠體重明顯持續(xù)增長；如果胚胎死亡而被吸收，孕鼠體重將停止增長，甚至下降。鼠類有吞噬畸形初生仔鼠的習(xí)性，所以應(yīng)在預(yù)計(jì)分娩日期的1～2天(大鼠受孕第19～20天、小鼠受孕第18～19天)，將孕鼠總數(shù)的3／4左右處死，檢查畸形情況。其余1／4可任其自然分娩，觀察仔鼠出生后至斷乳前可能出現(xiàn)的畸形及開眼、耳輪張開、出牙和生毛等一般發(fā)育情況。
(4)檢查項(xiàng)目 胎鼠外觀畸形檢查、胎鼠內(nèi)臟畸形檢查、胎鼠骨骼畸形檢查。
(5)致畸作用結(jié)果評(píng)定將上述結(jié)果按各劑量組進(jìn)行整理，計(jì)算畸胎發(fā)生率(畸胎對(duì)活胎的百分比)、畸形總數(shù)(在所有畸胎上發(fā)現(xiàn)的畸形總和)以及某一種顯著增多的畸形數(shù)目等，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與分析。自然情況下，各種動(dòng)物都會(huì)有一定的畸形發(fā)生率，因此不能根據(jù)個(gè)別畸形作肯定結(jié)論，必須當(dāng)試驗(yàn)組出現(xiàn)的畸形率顯著高于對(duì)照組，并且劑量效應(yīng)(畸形)關(guān)系較明顯時(shí)，才能認(rèn)為受試物對(duì)所用試驗(yàn)動(dòng)物有致畸性。
致畸性與其他效應(yīng)一樣，動(dòng)物種別甚至品系間差異很大，因此也不能根據(jù)對(duì)一種動(dòng)物具有致畸性就輕率作出對(duì)人致畸的結(jié)論；必要時(shí)可再用其他動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。在估計(jì)受試物質(zhì)對(duì)人體致畸的威脅時(shí)，既要考慮人與動(dòng)物的種間差異，還應(yīng)充分考慮試驗(yàn)劑量與人體實(shí)際可能攝人量之間的差別，后者尤為重要。只要對(duì)一種動(dòng)物具有致畸性就應(yīng)警惕該受試物可能對(duì)人體存在著同樣的威脅。目前國際上大量的用大鼠進(jìn)行的致畸試驗(yàn)純系出于實(shí)用的緣故。
在進(jìn)行致畸試驗(yàn)時(shí)，可根據(jù)受試物的性質(zhì)來選擇喂養(yǎng)致畸試驗(yàn)或傳統(tǒng)致畸試驗(yàn)。當(dāng)一種致畸試驗(yàn)的結(jié)果已能作出評(píng)價(jià)時(shí)，不要求再做另一種致畸試驗(yàn)。但在結(jié)果不足以作出評(píng)價(jià)時(shí)，或有關(guān)專家共同評(píng)議認(rèn)為需要時(shí)，再進(jìn)行另一種致畸試驗(yàn)。喂養(yǎng)致畸試驗(yàn)是在動(dòng)物性成熟時(shí)持續(xù)給藥，觀察子1B代(F1B)的畸形情況；傳統(tǒng)致畸試驗(yàn)則是交配后在雌性動(dòng)物孕期給藥，并在母鼠分娩前24～48h剖腹檢查胎鼠畸形情況。
四、致癌性試驗(yàn)
盡管評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)致癌性的方法較多，但由于致癌物作用的復(fù)雜性和各類致突變?cè)囼?yàn)的局限性，要最終確認(rèn)化學(xué)物對(duì)哺乳動(dòng)物的致癌性仍主要依賴長期致癌試驗(yàn)。在此僅就長期動(dòng)物致癌試驗(yàn)作一簡單介紹。
(1)準(zhǔn)備工作試驗(yàn)前應(yīng)掌握受試物的結(jié)構(gòu)一活性關(guān)系及其理化性質(zhì)，建立溶劑相生物材料中受試物(如可能還應(yīng)包括主要雜質(zhì))的定性、定量分析方法并確定受試物的成分及主要雜質(zhì)。
(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 對(duì)活性不明確的化學(xué)物建議使用兩種動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。嚙齒動(dòng)物應(yīng)優(yōu)先選擇大鼠和小鼠，因?yàn)樗鼈兊纳谙鄬?duì)較短，飼養(yǎng)成本低，對(duì)誘發(fā)腫瘤較敏感，較易獲得純系，研究者容易掌握其特性。在選擇品系時(shí)應(yīng)充分了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的特異敏感性。應(yīng)使用兩種性別、剛斷奶不久的年幼動(dòng)物，以便可在其大部分生命期中觀察腫瘤的發(fā)生，且保證觀察期與染毒期一致。
(3)動(dòng)物數(shù)量應(yīng)保證在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)劑量組和相應(yīng)的對(duì)照組至少有雌、雄各50只。若計(jì)劃在試驗(yàn)過程中處死一些動(dòng)物，則應(yīng)在試驗(yàn)開始時(shí)將此數(shù)量考慮進(jìn)去。
(4)染毒劑量一般至少設(shè)三個(gè)劑量組和相應(yīng)的對(duì)照組。最高劑量應(yīng)足以引起最低毒性表現(xiàn)，但又不致產(chǎn)生由非腫瘤因素造成的正常生命期限的明顯改變。毒性征象可表現(xiàn)為酶水平的改變或體重增長受到輕度抑制(降低應(yīng)低于10 %)。如與飼料混合在一起，則最高濃度不應(yīng)超過5％，但受試的營養(yǎng)素不受此限。最低劑量應(yīng)不影響動(dòng)物的正常生長、發(fā)育和壽命，即不能引起任何毒性表現(xiàn)。
(5)染毒方法可采用經(jīng)口、經(jīng)皮和吸入三種染毒方式。染毒途徑的選擇取決于受試物的理化特性和人的主要接觸方式，還需考慮技術(shù)上的可行性。只要能證明受試物可經(jīng)胃腸道吸收即應(yīng)首選經(jīng)口染毒。
(6)試驗(yàn)期限按下述原則確定試驗(yàn)期限。①一般情況下，小鼠和倉鼠在18個(gè)月、大鼠在第24個(gè)月結(jié)束試驗(yàn)。對(duì)于壽命較長或自發(fā)腫瘤率低的動(dòng)物品系，小鼠和倉鼠可在第24個(gè)月、大鼠在第30個(gè)月結(jié)束試驗(yàn)。②當(dāng)較低劑量組或?qū)φ战M的存活動(dòng)物數(shù)達(dá)25％時(shí)可以結(jié)束試驗(yàn)。對(duì)于有明顯性別差異的試驗(yàn)，可考慮分性別處理，不同性別動(dòng)物可在不同時(shí)間結(jié)束試驗(yàn)。如僅高劑量動(dòng)物因明顯的毒性作用過早死亡時(shí)，不應(yīng)結(jié)束試驗(yàn)。
合格陰性對(duì)照組的基本判別標(biāo)準(zhǔn)是：①任何組因組織自溶、自食或管理問題造成的動(dòng)物損害不超過10％；②小鼠和倉鼠試驗(yàn)第18個(gè)月、大鼠的第24個(gè)月各組動(dòng)物存活率不能少于50％。
對(duì)一種動(dòng)物有明確的致癌作用，即可認(rèn)為該受試物對(duì)人類有潛在的致癌危險(xiǎn)；但只有在至少用兩種動(dòng)物都得到陰性結(jié)果時(shí)，才能將該物質(zhì)對(duì)人的潛在致癌作用判為陰性。
參考資料：環(huán)境中有毒有害物質(zhì)與分析檢測
