常用毒理學試驗方法（五）
發布時間：2017-09-01
二、繁殖試驗
繁殖試驗是檢查受試物對動物繁殖生育功能影響的試驗。
(1)試驗目的 通過進行繁殖試驗，以確定動物攝人受試物后是否仍能正常交配受孕、能否保證胚胎正常發育、分娩過程是否順利以及后代出生后能否正常發育成長。
生殖系統對外界環境因素的作用非常敏感。外來化學物質可以引起生殖細胞損傷從而影響生殖過程，胚胎、胎兒和新生動物對外來化學物質也常常表現很敏感。
(2)試驗動物多用斷乳大鼠，也可采用小鼠、家兔等。
(3)劑量分組高劑量組可相當于90天毒性試驗中的最大無作用劑量。低劑量組可為高劑量組的若干分之一。同時要設置對照組。
(4)觀察指標主要觀察以下四個指標，分別反映動物交配受孕、妊娠過程、分娩過程和哺育幼仔成活情況。
如果仔鼠在出生后4天內死亡，則可能由于分娩過程發生障礙，損傷幼仔所致。如在出生后21天內仔鼠死亡，則表示母鼠哺育能力發生障礙。
除上述各項指標外，還可觀察仔鼠生長發育情況和一般健康狀況，記錄進食量、死亡率，并計算飼料效價。飼養3個月后，還可觀察性成熟情況。仔鼠出生時和斷奶時的體重、身長和尾長可作為生長發育的指標。
三、致畸試驗
某些化學物質，可通過妊娠母體干擾正常的胚胎發育而引起胚胎畸形。目前已知與環境有關的致畸物有四氯二苯并二嘿英、敵枯雙、五氯酚(鈉)、滴滴涕、氯丹、黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A等。大量維生素A也有致畸作用。
(1)實驗動物常用受孕雌性大鼠、小鼠和家兔等，有條件時也可用狗和猴進行試驗。具體試驗中最好選用大鼠，因其具有自然畸胎率低、胎仔大小適中便于檢查、實用性強等優點。
(2)受試物劑量可根據目的和方法來確定。如果只是定性檢查被檢物有無致畸作用，組數可少些，每組動物數應較多，劑量應較高。如果試驗期間只給予受試物一次，則劑量應較高，多次給予時劑量應較低。一般情況下，高劑量與低劑量之間可適當插入1～3個至4～5個中間劑量組。每組動物數大鼠、小鼠應不少于10～20只。同時還要設置陰性對照組和陽性對照組。陽性對照組動物要給予已知的致畸物，例如敵枯雙、五氯酚等。
(3)試驗步驟將選定的大鼠或小鼠按雌雄2∶1進行同籠交配，并準確掌握其受精日期。對每只孕鼠應準確記錄受精日期、給予被檢物日期和劑量。每2～3天稱體重一次，并調整劑量，也可對孕鼠及胚胎受被檢物影響的程度作出估計。如孕鼠的胚胎發育正常，則孕鼠體重明顯持續增長；如果胚胎死亡而被吸收，孕鼠體重將停止增長，甚至下降。鼠類有吞噬畸形初生仔鼠的習性，所以應在預計分娩日期的1～2天(大鼠受孕第19～20天、小鼠受孕第18～19天)，將孕鼠總數的3／4左右處死，檢查畸形情況。其余1／4可任其自然分娩，觀察仔鼠出生后至斷乳前可能出現的畸形及開眼、耳輪張開、出牙和生毛等一般發育情況。
(4)檢查項目 胎鼠外觀畸形檢查、胎鼠內臟畸形檢查、胎鼠骨骼畸形檢查。
(5)致畸作用結果評定將上述結果按各劑量組進行整理，計算畸胎發生率(畸胎對活胎的百分比)、畸形總數(在所有畸胎上發現的畸形總和)以及某一種顯著增多的畸形數目等，并進行統計學處理與分析。自然情況下，各種動物都會有一定的畸形發生率，因此不能根據個別畸形作肯定結論，必須當試驗組出現的畸形率顯著高于對照組，并且劑量效應(畸形)關系較明顯時，才能認為受試物對所用試驗動物有致畸性。
致畸性與其他效應一樣，動物種別甚至品系間差異很大，因此也不能根據對一種動物具有致畸性就輕率作出對人致畸的結論；必要時可再用其他動物進行試驗。在估計受試物質對人體致畸的威脅時，既要考慮人與動物的種間差異，還應充分考慮試驗劑量與人體實際可能攝人量之間的差別，后者尤為重要。只要對一種動物具有致畸性就應警惕該受試物可能對人體存在著同樣的威脅。目前國際上大量的用大鼠進行的致畸試驗純系出于實用的緣故。
在進行致畸試驗時，可根據受試物的性質來選擇喂養致畸試驗或傳統致畸試驗。當一種致畸試驗的結果已能作出評價時，不要求再做另一種致畸試驗。但在結果不足以作出評價時，或有關專家共同評議認為需要時，再進行另一種致畸試驗。喂養致畸試驗是在動物性成熟時持續給藥，觀察子1B代(F1B)的畸形情況；傳統致畸試驗則是交配后在雌性動物孕期給藥，并在母鼠分娩前24～48h剖腹檢查胎鼠畸形情況。
四、致癌性試驗
盡管評價化學物質致癌性的方法較多，但由于致癌物作用的復雜性和各類致突變試驗的局限性，要最終確認化學物對哺乳動物的致癌性仍主要依賴長期致癌試驗。在此僅就長期動物致癌試驗作一簡單介紹。
(1)準備工作試驗前應掌握受試物的結構一活性關系及其理化性質，建立溶劑相生物材料中受試物(如可能還應包括主要雜質)的定性、定量分析方法并確定受試物的成分及主要雜質。
(2)實驗動物 對活性不明確的化學物建議使用兩種動物進行試驗。嚙齒動物應優先選擇大鼠和小鼠，因為它們的生命期相對較短，飼養成本低，對誘發腫瘤較敏感，較易獲得純系，研究者容易掌握其特性。在選擇品系時應充分了解實驗動物的特異敏感性。應使用兩種性別、剛斷奶不久的年幼動物，以便可在其大部分生命期中觀察腫瘤的發生，且保證觀察期與染毒期一致。
(3)動物數量應保證在試驗結束時，每個劑量組和相應的對照組至少有雌、雄各50只。若計劃在試驗過程中處死一些動物，則應在試驗開始時將此數量考慮進去。
(4)染毒劑量一般至少設三個劑量組和相應的對照組。最高劑量應足以引起最低毒性表現，但又不致產生由非腫瘤因素造成的正常生命期限的明顯改變。毒性征象可表現為酶水平的改變或體重增長受到輕度抑制(降低應低于10 %)。如與飼料混合在一起，則最高濃度不應超過5％，但受試的營養素不受此限。最低劑量應不影響動物的正常生長、發育和壽命，即不能引起任何毒性表現。
(5)染毒方法可采用經口、經皮和吸入三種染毒方式。染毒途徑的選擇取決于受試物的理化特性和人的主要接觸方式，還需考慮技術上的可行性。只要能證明受試物可經胃腸道吸收即應首選經口染毒。
(6)試驗期限按下述原則確定試驗期限。①一般情況下，小鼠和倉鼠在18個月、大鼠在第24個月結束試驗。對于壽命較長或自發腫瘤率低的動物品系，小鼠和倉鼠可在第24個月、大鼠在第30個月結束試驗。②當較低劑量組或對照組的存活動物數達25％時可以結束試驗。對于有明顯性別差異的試驗，可考慮分性別處理，不同性別動物可在不同時間結束試驗。如僅高劑量動物因明顯的毒性作用過早死亡時，不應結束試驗。
合格陰性對照組的基本判別標準是：①任何組因組織自溶、自食或管理問題造成的動物損害不超過10％；②小鼠和倉鼠試驗第18個月、大鼠的第24個月各組動物存活率不能少于50％。
對一種動物有明確的致癌作用，即可認為該受試物對人類有潛在的致癌危險；但只有在至少用兩種動物都得到陰性結果時，才能將該物質對人的潛在致癌作用判為陰性。
參考資料：環境中有毒有害物質與分析檢測
