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單端孢霉烯族化合物（二）
發(fā)布時間：2017-09-01
(2)測定
①薄層板的制備。稱取硅膠G4g，加水10mL于乳缽中，研磨至糊狀后，立即倒人涂布器內(nèi)，制成5cm×10cm、厚度為0．3mm的薄層板3塊，在空氣中干燥15min后，在105～110℃活化2～3h，取出放干燥器中保存。
②點樣。用10μL微量注射器在一塊5cm×10cm的硅膠G薄層板上距下端1cm處點3點：標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL、樣品提取液10μL、樣品提取液10μL加標(biāo)準(zhǔn)液10pL。邊點樣邊用吹風(fēng)機吹干，點上一滴吹干后再繼續(xù)滴加。
③展開。在展開槽內(nèi)加乙酸乙酯-甲苯(3+1)15mL，將薄層板浸入溶劑中，展至18cm，取出揮干。
④顯熒光。于薄層板上噴上一層均勻、濕度合適的20％硫酸甲醇溶液，置110℃下10min，取出后在紫外光分析儀下觀察。
⑤觀察與評定。將薄層板置紫外光分析儀下，同時應(yīng)用長波紫外光(365nm)和短波紫外光(275nm)觀察。如樣液點處與標(biāo)準(zhǔn)點相近位置上未出現(xiàn)藍(lán)色熒光點，則樣品中T-2毒素的含量在方法靈敏度200μg／kg以下；若出現(xiàn)熒光點的強度與標(biāo)準(zhǔn)點的最低檢出量的熒光強度相等，且此熒光點與加入內(nèi)標(biāo)的點重疊，則樣品中T-2毒素含量為200μg／kg；若出現(xiàn)熒光點的強度比標(biāo)準(zhǔn)點的最低檢出量強，則據(jù)其熒光強度估計減少滴加的體積(μL)，或?qū)右合♂尯笤偌硬煌w積(μL)，直至樣液點的熒光強度與最低檢出量的熒光強度一致為止。
4、計算
式中0.04――T-2毒素最低檢出量，μg；
V1――加入丙酮的體積，mL；
V2――出現(xiàn)最低熒光時滴加樣液的體積，mL；
n――樣液的總稀釋倍數(shù)；
m――丙酮溶解時相當(dāng)樣品的質(zhì)量，g。
(二)小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的測定
1、原理
小麥中DON經(jīng)提取、凈化、濃縮和硅膠G薄層展開后，加熱薄層板。由于在制備薄層板時加入了三氯化鋁，使DON在365nm紫外光燈下顯藍(lán)色熒光，與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。
2、試劑
DON標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取5mg DON，加乙酸乙酯溶液后轉(zhuǎn)入10mL容量瓶中，加乙酸乙酯至刻度。此標(biāo)準(zhǔn)溶液含DON 0.5mg／mL。吸取此標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5mL，用乙酸乙酯稀釋至10mL，此溶液每毫升含DON 25μg。
3、測定
(1)提取稱取20g粉碎的小麥樣品，置于200mL具塞錐形瓶中，加8mL水和100mL三氯甲烷-無水乙醇(8+2)，密塞，在瓶塞上涂上一層水蓋嚴(yán)防漏，振蕩lh，通過折疊快速定性濾紙過濾，取25mL濾液于75mL玻璃蒸發(fā)皿中，置80～90℃水浴上通風(fēng)揮干。用40mL正己烷分次溶解蒸發(fā)皿中的殘渣，洗入lOOmL分液漏斗中，再用20mL甲醇-水(4+1)分次洗滌蒸發(fā)皿，轉(zhuǎn)入同一分液漏斗中，振搖1.5min，靜置約15min，使分層后，將下層甲醇-水提取液過柱凈化，不要將兩相交界處的白色絮狀物放入柱內(nèi)。
(2)凈化 在層析柱下端與小管相連接處塞約0.1g脫脂棉，盡量塞緊。先裝入0.5g中性氧化鋁。敲平表面，再加入0.4g活性炭，敲緊。將層析柱下端小管插入一橡皮塞，塞在抽濾瓶上，抽濾瓶中放一平底管接收過柱液。將抽濾瓶接上水泵或真空泵，稍稍開啟泵使活性炭壓緊。將分液漏斗中的甲醇一水提取液小心沿管壁加入柱內(nèi)，控制流速為每15s 18～20滴。甲醇一水提取液過柱快完畢時，加入10mL甲醇一水(4+1)淋洗柱抽濾，直至柱內(nèi)不再有液體流出，使30mL液體在10～11min內(nèi)過柱完畢。過柱速度要均勻，不要時快時慢。
(3)制備薄層層析用樣液 將過柱后的洗脫液倒入75mL玻璃蒸發(fā)皿中，用少量甲醇-水(4+1)洗滌平底管。將蒸發(fā)皿置沸水浴上濃縮至干(約40min)，趁熱加入3mL乙酸乙酯，加熱至沸，在水浴鍋上輕輕地反復(fù)轉(zhuǎn)動蒸發(fā)皿數(shù)次，使充分沸騰，將殘渣中的DON溶出(如乙酸乙酯溶液太少或被揮干，可再加入適量)。放冷至室溫后轉(zhuǎn)入濃縮瓶中，再用3份l～5mL乙酸乙酯洗滌蒸發(fā)皿，并入濃縮瓶中。將濃縮瓶置約950C水浴上用蒸汽加熱吹N。濃縮至干，放冷至室溫后加入0～2mL三氯甲烷一乙腈(4+1)溶解殘渣留作薄層層析用。
(4)薄層層析
①薄層板的制備。取4g硅膠G，加10mL 15％A1C13?6H2O水溶液，研磨約2～5min至呈黏稠狀，鋪成5cm×20cm的薄層板3塊，置室溫干燥后，于1050C活化1h，儲于干燥器中備用。
②展開劑。橫展劑為乙醚、乙醚-丙酮(95+5)、無水乙醚。其中任意一種，使樣品DON點偏離原點0.7～1.Ocm，剛好與雜質(zhì)熒光分開?？v展劑為三氯甲烷-丙酮-異丙醇(8+1+1)。
③點樣。在每塊薄層板上距下端2.5cm的基線上點樣。
第一塊板：對每一個樣品，先點第一塊薄層板。在距板左邊緣O.8～1cm處點樣液25μL，在距左邊緣約2cm處點標(biāo)準(zhǔn)液lμL(25ng)，在距右邊緣1．2cm處點標(biāo)準(zhǔn)液20μL(500ng)，再在薄層板上距上端3cm處的橫線上，與下端基線上三點相對應(yīng)的位置點3個DON標(biāo)準(zhǔn)點，各2μL(50ng)。DON的最低檢出量達(dá)25ng，目視比較用50ng、75ng、100ng。薄層板經(jīng)展開顯熒光后，如陽性樣品的DON點熒光強度小于500ng DON標(biāo)準(zhǔn)點，則不需要稀釋，只要估計減少滴加量；如樣品DON點熒光強度大于500ng標(biāo)準(zhǔn)點，需稀釋后估計滴加量。
第二塊板：在第一塊板上未顯熒光的樣品，則需在第二塊薄層板上距左邊緣O．8～1．Ocm處滴加樣液25μL加標(biāo)準(zhǔn)液1μL(25ng)，在距左邊緣約2cm處滴加標(biāo)準(zhǔn)液2μL(50ng)。對陽性樣品進行概略定量：在薄層板上距左邊緣0.8～1.Ocm處滴加樣液點(根據(jù)情況估計滴加量)，在距左邊緣約2cm處和在距右邊緣1.2cm處分別滴加兩個標(biāo)準(zhǔn)點，DON量可為50ng、75ng、10Ong，根據(jù)情況選擇滴加量。
④展開。展開槽均不先加入溶劑飽和。橫展：在展開槽內(nèi)倒入10mL橫展劑，將點好樣的薄層板靠樣液點的長邊斜浸入溶劑，展至板端，過1min取出，通風(fēng)揮干5min?？v展：在展開槽內(nèi)倒入10mL縱展劑，將橫展揮干后的薄層板置展開槽內(nèi)縱展13cm(約35min)，取出通風(fēng)揮干10min。
⑤顯熒光。先觀察未加熱的薄層板，可見到顯藍(lán)紫色熒光的干擾點(這時DON點不顯熒光)，加熱后它也顯熒光，在DON點附近，但不干擾DON點。然后將此薄層板置130℃烘箱中加熱7～10min，取出放在冷的表面上，1min后于365nm紫外光燈下觀察。
⑥觀察與評定。薄層板經(jīng)橫展后，板上的DON點都有移動，樣品的DON點移動約0.7～1.Ocm，正是根據(jù)這一點在縱展后使樣品DON點擺脫了雜質(zhì)熒光的干擾。薄層板上端未經(jīng)縱展的3個DON標(biāo)準(zhǔn)點可分別作為縱展后樣品DON點和2個DON標(biāo)準(zhǔn)點的橫向定位點。樣品DON點又可與縱展后的DON標(biāo)準(zhǔn)點比較R1值而定性。這樣從橫向和縱向兩個方面確定樣品DON的位置，達(dá)到定性的目的。在第一塊薄層板上如樣品DON點上有很淺的斜的熒光通過，這是過柱時沒有掌握好速度，凈化不夠，也可能是空氣濕度的變化，影響分離效果，但兩個標(biāo)準(zhǔn)DON點的位置上均無雜質(zhì)熒光干擾。
如在第一塊薄層板上樣液未顯熒光點，而在第二塊薄層板上樣液25μL加標(biāo)準(zhǔn)25ng所顯熒光強度與標(biāo)準(zhǔn)25ng相等，則樣品中DON含量為陰性或為50gg／kg以下。陽性樣品概略定量時，雖然薄層板上3個DON點在橫展中都稍有移動，但對各點熒光強度無影響，2個標(biāo)準(zhǔn)點均可用于和樣品DON點比較熒光強度。
薄層光密度計測定：在薄層板上標(biāo)準(zhǔn)DON熒光點至少在100ng、200ng、400ng時，測得的響應(yīng)與DON的量才呈線性關(guān)系。
對DON含量在300μg／kg以上的樣品才用光密度計測定。當(dāng)DON含量在300μg／kg時，點樣液20μL使測得的DON的量落在10O～200ng之間。用薄層掃描儀測定時，每塊薄層板上滴加2個標(biāo)準(zhǔn)DON點，DON的量為100ng、200ng或200ng、400ng。在激發(fā)波長340nm、發(fā)射波長400nm條件下進行測定，以測得的峰面積值為縱坐標(biāo)，DON量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4、計算
DON含量(mg／kg)
式中 A――薄層板上測得樣品點上DON的量，μg；
V1――加入三氯甲烷-乙腈混合液溶解殘渣的體積，mL；
V2――滴加樣液的體積，mL；
n――樣液的總稀釋倍數(shù)；
m――三氯甲烷-乙腈混合液溶解殘渣相當(dāng)樣品的質(zhì)量，g。
參考資料：環(huán)境中有毒有害物質(zhì)與分析檢測
