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高效液相色譜-化學發光法檢測牛奶中磺胺類藥物殘留

發布時間：2017-08-03

1 引言

磺胺類藥物(Sulfonamides，SAs)為人工合成的一類抗菌藥物，在獸醫臨床上廣泛用于預防和治療動物細菌感染性疾病，常用磺胺藥物有磺胺脒(Sulfaguanidine，SGD)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine，SDZ)、磺胺噻唑(Sulfathiazole，STZ)、磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine，SMZ)等。動物飼養過程中若長期使用抗生素類藥物，會使動物體內致病細菌產生耐藥，給動物疾病檢疫與防治帶來不利影響，且會使藥物殘留在動物體內。磺胺類藥物殘留期長, 在畜禽等動物源性食品中的殘留，嚴重危害食品安全與公眾健康。

文獻報道了許多用于檢測動物源性食品中磺胺類藥物多組分殘留的方法，其中以高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)應用最普遍[1]。反相HPLC連接紫外(UV)[2]、二極管陣列(DAD)[3]、熒光(FL)[4]檢測器廣泛用于食品、環境中SAs殘留的例行分析，HPLC-MS/MS以其高靈敏度及選擇性用于檢測或確證分析中[5, 6]。UV、DAD檢測器用于磺胺類及其它抗生素殘留檢測時靈敏度受限; FL檢測器靈敏度高，但SAs需柱前衍生，合適的衍生試劑不易篩選; MS或MS/MS檢測器最有優勢，但儀器及運行成本的壓力，使其不易普及。

近年來，化學發光分析法(Chemiluminescence，CL)以其靈敏度高、線性范圍寬、儀器設備簡單、分析速度快等優點，廣泛用于環境、生物、生化樣品分析中[7~9]。魯米諾(Luminol)體系是最經典的化學發光體系[10~12]，其發光機理為：魯米諾在堿性條件下被氧化劑氧化，氧化產物吸收氧化還原反應放出的熱量后被激發，激發態回到基態輻射發光。本課題組在前期研究中發現，過渡金屬超常氧化態與適當多齒配體絡合形成的配合物，在一定條件下能穩定存在并具有較強的氧化性能，如Ag(Ⅲ)和Ni(Ⅳ)與過碘酸形成的配合物[Ag(HIO6)2]5-, [Ni(HIO6)2(OH)2]6-在堿性條件下是良好的氧化劑[13~16]。將Ag(Ⅲ)、Ni(Ⅳ)配合物與魯米諾組成化學發光體系，通過待測組分對Ag(Ⅲ)、Ni(Ⅳ)-Luminol發光體系的增敏或抑制作用，已成功用于β2-受體激動劑、皮質醇等多種藥物或生物分子的檢測，且具有極高的靈敏度[17, 18]。

化學發光靈敏度高，但方法的選擇性差。若將HPLC的高效分離能力與CL的高靈敏性結合，首先采用HPLC將混合物中的各組分得到有效分離，再利用化學發光檢測系統對各組分進行靈敏檢測，是一種兼顧高靈敏度與高分辨力的物質分離與檢測新方法。本實驗以動物源性食品中最易殘留的4種磺胺類藥物，即磺胺脒、磺胺嘧啶、磺胺噻唑和磺胺二甲嘧啶為分析物，基于其對Ag(Ⅲ)-Luminol與Ni(Ⅳ)-Luminol兩化學發光體系發光強度均具有抑制作用的性質，建立了HPLC-CL檢測體系同時分離分析牛奶中4種磺胺類藥物的方法，并對兩種檢測器的性能進行了比較，為HPLC法在抗生素殘留檢測中新檢測器的開發提供了思路。同時，對比Ag(Ⅲ)-Luminol與Ni(Ⅳ)-Luminol兩體系在檢測靈敏度及檢測穩定性等方面的不同，以期更好地與高效液相色譜聯用。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

SPD-15C高效液相色譜儀(島津公司); IFFM-E型流動注射化學發光分析儀(西安瑞邁分析儀器有限責任公司); SB5200DT超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司); TU1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析儀器公司); HN-500超聲波信號發生器(上海汗諾儀器有限公司)。

磺胺脒(SGD)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺噻唑(STZ)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)，純度 > 98%，均購于德國Dr. Ehrenstorfer公司; 魯米諾(日本TCI公司); 甲醇(瑞典Oceanpa公司)等。甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

SGD、SDZ、STZ、SMZ儲備溶液：稱取適量SGD、SDZ、STZ、SMZ標準品，用40%甲醇配制成1.0 mg/mL的標準儲備液。其中磺胺嘧啶配制過程中加入幾滴0.1 mol/L NaOH溶液促進溶解，-4℃保存。使用時，以純水稀釋至所需濃度。

魯米諾儲備溶液：稱取適量魯米諾標準品，溶于1.0 mol/L NaOH溶液中，以超純水定容。

Ag(Ⅲ)和Ni(Ⅳ)配合物儲備液分別依據文獻[19, 20]制備，[Ag(HIO6)2]5-儲備液濃度由其362 nm處的摩爾吸光系數(ε=1.26×104 L·mol-1·cm-1)測定得到。依據[Ni(HIO6)2(OH)2]6-配合物在410 nm處的摩爾吸光系數(ε=1.06×105 L·mol-1·cm-1)測定儲備液中Ni(Ⅳ)配離子濃度。工作液均用超純水稀釋。

2.2 高效液相色譜-化學發光檢測裝置

本實驗系統由高效液相分離裝置和化學發光檢測體系裝置通過三通接頭和聚四氟乙烯管連接而成。液相部分由高壓輸送泵、進樣系統、色譜柱等組成，化學發光部分由蠕動泵、光電倍增管、檢測池等組成。實驗通路如圖 1所示：樣品由六通閥進樣后，經色譜柱分離、進入檢測器，與此同時Ag(Ⅲ)或Ni(Ⅳ)與魯米諾溶液經三通閥“5”處混合并發生反應，流經三通閥“6”時與樣品溶液混合，進入檢測池檢測發光強度。色譜條件：C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm); 流動相0.1%甲酸-甲醇混合液，甲醇用前以微孔有機濾膜(0.45 μm)過濾，0.1%甲酸溶液用微孔水系濾膜(0.45 μm)過濾，超聲脫氣; 流速：1.0 mL/min; 溫度：30℃; 進樣量：20 μL。梯度洗脫程序見表 1。化學發光條件：試劑流速1.0 mL/min; [Ag(Ⅲ)]=1.4×10-4 mol/L; [Ni(Ⅳ)]=1.5×10-5 mol/L; [NaOH]=0.12 mol/L; [Luminol]=1.2×10-7 mol/L; L1=3 cm，L2=2 cm。

2.3 樣品處理

根據國家標準方法[21]，取樣品(5.0±0.5) mL，置于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入25 mL 0.1% HClO4溶液，用水調節至pH 2，于渦旋振蕩器振蕩提取1 min，超聲波萃取10 min，備用。HLB固相萃取柱依次用3 mL甲醇和5 mL 0.1% HClO4 (pH 2) 活化，取備用液過柱，再用5 mL超純水淋洗，抽干，用3 mL甲醇洗脫。收集洗脫液，于40℃氮氣吹至0.2 mL，甲醇-0.1%甲酸(1：19，V/V)溶液補至1.0 mL，過0.45 μm濾膜過濾，待測。

3 結果與討論

3.1 高效液相色譜條件的優化

初步實驗表明，在本實驗體系中，高效液相色譜有機相的比例對化學發光體系的影響較大，當甲醇或乙腈的有機相的比例過大時，一方面造成HPLC-CL體系的基線噪聲大，且重復性較差，另一方面，由于高效液相色譜裝置與化學發光裝置通過有機玻璃三通閥連接，甲醇、乙腈等有機溶劑易腐蝕玻璃，對實驗設備及實驗結果產生一定影響，故在實驗過程中應控制高效液相色譜中有機相的比例。

HPLC法測定磺胺類藥物的流動相體系主要有：乙酸-乙腈，甲醇-磷酸鹽溶液等[22~26]。實驗發現，乙腈-磷酸鹽、甲醇-乙酸及甲醇-甲酸體系均能使4種磺胺類物質得到較好的分離，但結合化學發光體系表明，乙腈較甲醇對化學發光信號的影響較大，乙酸較甲酸對化學發光信號的影響較大，均造成基線不穩定、噪聲大等情況，故最終確定流動相為甲醇-0.1%甲酸。

進一步研究表明，隨著甲醇比例的增大，化學發光信號的基線噪聲隨之增大。且由于磺胺脒柱上的保留較弱，為使4種檢測物質均能在最佳時間內出峰，采用了梯度洗脫程序。綜合考慮分離效果及化學發光信號穩定情況，采用表 1梯度洗脫程序，流速1.0 mL/min時，4種被檢物質均能在25 min之內流出，且峰形良好，同時保證了對化學發光信號穩定程度的影響最小。

3.2 化學發光條件的優化

3.2.1 化學發光裝置流路參數的選擇

在其它條件一定的情況下，考察了試劑流速對信噪比的影響。結果表明，試劑流速在1.0 mL/min時信噪比為最佳。

3.2.2 Ag(Ⅲ)和Ni(Ⅳ)濃度的優化

考察了5.0×10-5~2.0×10-4 mol/L濃度范圍內的Ag(Ⅲ)和5.0×10-6~3.0×10-5 mol/L的Ni(Ⅳ)配合物濃度對光強及信噪比的影響(圖 2)。結果表明，隨著Ag(Ⅲ)和Ni(Ⅳ)濃度增大，化學發光信號逐漸增大。但隨著信號的增強，信噪比隨之減小。當Ag(Ⅲ)和Ni(Ⅳ)的濃度分別為1.4×10-4mol/L和1.5×10-5 mol/L時，兩體系中被測物質相對化學發光信號較強，信噪比最大，最終確定此濃度為實驗最佳濃度。

3.2.3 Ag(Ⅲ)和Ni(Ⅳ)配合物溶液中NaOH濃度的優化

分別考察Ag(Ⅲ)和Ni(Ⅳ)配合物溶液中NaOH濃度(0.05~0.30 mol/L)對Ag(Ⅲ)-Luminol和Ni(Ⅳ)-Luminol化學發光體系相對化學發光強度的影響。結果表明，NaOH濃度增加，4種磺胺類藥物對兩種體系的化學發光強度的抑制作用增強，且噪聲隨之增大，當NaOH濃度為0.12 mol/L時，磺胺類藥物對兩種體系的化學發光信號的抑制作用最強，且信號穩定，信噪比較大(圖 3)。故本實驗最終選擇Ag(Ⅲ)和Ni(Ⅳ)配合物溶液堿度均為0.12 mol/L。

3.2.4 魯米諾溶液濃度的優化

在5.0×10-8~2.0×10-7 mol/L范圍內考察魯米諾溶液濃度對化學發光信號強度及噪聲的影響(圖 4)。結果表明，隨著魯米諾濃度升高，相對化學發光強度逐漸增大。但當其濃度為1.5×10-7 mol/L時，基線噪聲顯著上升，造成信號不穩定，影響峰高，且信噪比逐漸減小。故實驗中最佳魯米諾濃度選擇為1.2×10-7 mol/L。

3.3 工作曲線、精密度與檢出限

在優化的條件下，對磺胺類物質系列標準溶液進行測定，回歸方程、檢出限等參數見表 2和表 3。檢出限的峰高值為3倍的基線噪聲(S/N=3)。對樣品進行7次平行測定，兩體系相對標準偏差分別為1.0%~2.1%和1.0~1.9%。

3.4 Ag(Ⅲ)-Luminol及Ni(Ⅳ)-Luminol化學發光機理推斷

Ag(Ⅲ)、Ni(Ⅳ)過碘酸配合物在堿性介質中均為良好的氧化劑，Ag(Ⅲ)配合物氧化還原電位E＝1.74 V[26], 較Ni(Ⅳ)配合物的電位高，氧化能力更強。氧化目標物時，Ag(Ⅲ)反應速度較Ni(Ⅳ)配合物快，但實驗表明，Ni(Ⅳ)配合物氧化體系更穩定; 分別與魯米諾組成化學發光體系后，Ag(Ⅲ)體系較Ni(Ⅳ)體系更靈敏，但Ni(Ⅳ)體系檢測范圍更廣。

采用Ag(Ⅲ)-Luminol和Ni(Ⅳ)-Luminol兩化學發光體系作為HPLC檢測器對磺胺類藥物進行檢測時，前者更為靈敏，檢出限明顯較低，線性范圍較寬，而Ni(Ⅳ)檢測體系較前者穩定性好。Ag(Ⅲ)與Ni(Ⅳ)的氧化能力與其濃度、NaOH濃度有關，隨著配合物濃度增大，Ag(Ⅲ)-Luminol體系及Ni(Ⅳ)-Luminol體系的化學發光強度呈增強-降低-再增強-再降低的趨勢，這可能與配合物在不同條件下配位平衡發生改變，從而影響其氧化能力有關。

據前期研究[27, 28]推斷，此檢測體系可能的檢測機理為：在堿性介質中，作為氧化劑的Ag(Ⅲ)及Ni(Ⅳ)配合物與魯米諾組成化學發光體系，配合物氧化魯米諾產生化學發光，即為基線信號(I0)。4種磺胺類藥物經HPLC分離后進入CL檢測體系，分別與兩化學發光體系作用，產生發光信號(It), 且對基線強度均有抑制作用，相對減弱強度ΔI(ΔI=I0－It)與磺胺藥物濃度C呈線性關系。Ag(Ⅲ)、Ni(Ⅳ)配合物和魯米諾及磺胺藥物的反應均為自由基反應，而磺胺類藥物與Ag(Ⅲ)和Ni(Ⅳ)配合物的反應速率較與魯米諾反應速率慢，反應過程中，魯米諾產生的自由基轉移給磺胺類藥物一部分，從而使魯米諾的自由基減少，發光體的量減少，使得體系的發光強度降低。