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電化學發光免疫分析法測定血清胰島素
發布時間：2013-09-17
胰島素是由胰島β細胞分泌的一種肽類激素,其血清濃度測定是評價糖尿病患者β細胞功能的常用指標。其測定方法包括放免(RIA)、酶(ELISA)、電化學發光(ECLTA)等,因各方法特異性、敏感性和試劑穩定性不同,測定結果差異大,故給臨床診治造成不便。本文用ECLIA和RIA法測定血清胰島素、ELISA法測血清C-肽濃度,旨在探討用ECLIA法測定血清胰島素用于評價胰島β細胞功能的可行性。
資料與方法:
1ECLIA的工作原理:
發光試劑三聯吡啶釕[Ru(bpy)32+]和電子供體三丙胺(TPA)在陽電極表面發生氧化還原反應。通過熒光機制衰減,發射波長為620nm的光子,這一電化學反應過程周而復始地進行,產生許多光子,使信號得以增強,檢測更加靈敏。ECLIA采用磁性微珠鏈霉親和素-生物素捕獲系統,使抗原-抗體反應得以在磁性微珠表面快速進行,從而大大縮短反應時間(<20分鐘)。反應步驟以雙抗夾心法檢測抗原為例:Ru(bpy)32+標記的抗體、包被好的磁珠、待測樣品共同溫育,形成Ru(bpy)32+-抗體-抗原-抗體-磁性微珠復合體。然后蠕動泵將反應液吸入流動室,在這里,磁性微珠被工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面,加入TPA,電極加電壓,啟動ECL反應,由光電倍增管檢測光強度光強度與Ru(bpy)32+的濃度呈線形關系,據此可測出待測抗原的含量。
2儀器與試劑:
采用德國Roche公司生產的Elecsys2010全自動電化學發光分析儀及配套試劑。RIA法試劑由中國原子能科學研究院提供,γ計數儀型號為西安262T2008P。C-肽試劑由美國BIOSOURCE公司提供,酶標儀是美國BIORAD生產的550型號。3標本來源:采自門診和住院已被確診的糖尿病患者,不合并肝腎等急慢性疾患,未用胰島素治療,口服藥物治療者停服磺脲類降糖藥
3天后采血。
將血清置于-20℃冰箱貯存,待測ECLIA法和RIA法胰島素及ELISA法測C-肽。結果:方法學評價:
（1）重復性實驗:取低、中、高三個濃度的血清,每個濃度分10份檢測,計算批內誤差,結果ECLIA批內CV為1.97%,RIA批內CV為10.18%;用低、中、高三25個濃度血清3次獨立試驗測定,每次10份,計算批間誤差。結果ECLIA批間CV為2.56%,RIA批間CV為13.21%。
（2）回收率:取低、中、高三組定值血清,檢測3次,計算平均回收率,分別為98.6%、102%、97.7%,平均99.5%。（
3）方法學比較:用ECLIA法和RIA法分別測標本,將結果進行相關回歸分析。相關系數r=0.987,假設性檢驗P<0.01。
（4）干擾試驗:取一份定值血清,分別加入不同濃度膽紅素、甘油三酯和血紅蛋白標準液,以±10%以內作為無明顯干擾。結果膽紅素<153μmol/L、甘油三酯<20μmol/L時無明顯干擾,溶血使結果明顯下降。
β細胞分泌胰島素時同時等分子產生C-肽,C-肽在血中半衰期較胰島素長,因此常通過測C-肽濃度評價β細胞分泌胰島素的功能。將所有標本同時測C-肽,分別與ECLIA和RIA法測定的胰島素結果進行相關分析。ECLIA法測得胰島素與C-肽的相關系數是0.94,RIA法測得胰島素與C-肽的相關系數是0.91,兩個相關系數的差別有統計學意義(P<0.01)。
討論:
RIA是臨床最常用測定胰島素的方法,但由于其與胰島素原及胰島素類似物的交叉反應高,難以為評價胰島β細胞功能提供準確的依據,故常同時測定C-肽濃度。ECLIA為電促發光,其結果穩定、靈敏度高、無放射性污染等問題,與其它免疫檢測手段相比較具有明顯的優勢。ECLIA法測胰島素與胰島素原的交叉反應為0.05%,與糖原、生長激素無交叉反應,與胰島素樣生長因子交叉反應為0.04%,顯示了良好的特異度。溶血標本對測定結果影響明顯,采集標本時應避免溶血。本文顯示ECLIA法測定胰島素的各種方法學評價指標均優于RIA法(P<0.01),并且ECLIA法測定胰島素與C-肽相關性亦優于RIA法(P<0.01),說明ECLIA法測定的胰島素代表了體內真正起生物學作用的胰島素濃度,即真胰島素濃度。由于ECLIA法是目前最快捷的檢測方法,因此為臨床診治糖尿病提供了更加迅速可靠的證據。
