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電化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定血清胰島素
發(fā)布時(shí)間：2013-09-17
胰島素是由胰島β細(xì)胞分泌的一種肽類激素,其血清濃度測(cè)定是評(píng)價(jià)糖尿病患者β細(xì)胞功能的常用指標(biāo)。其測(cè)定方法包括放免(RIA)、酶(ELISA)、電化學(xué)發(fā)光(ECLTA)等,因各方法特異性、敏感性和試劑穩(wěn)定性不同,測(cè)定結(jié)果差異大,故給臨床診治造成不便。本文用ECLIA和RIA法測(cè)定血清胰島素、ELISA法測(cè)血清C-肽濃度,旨在探討用ECLIA法測(cè)定血清胰島素用于評(píng)價(jià)胰島β細(xì)胞功能的可行性。
資料與方法:
1ECLIA的工作原理:
發(fā)光試劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)32+]和電子供體三丙胺(TPA)在陽(yáng)電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)。通過(guò)熒光機(jī)制衰減,發(fā)射波長(zhǎng)為620nm的光子,這一電化學(xué)反應(yīng)過(guò)程周而復(fù)始地進(jìn)行,產(chǎn)生許多光子,使信號(hào)得以增強(qiáng),檢測(cè)更加靈敏。ECLIA采用磁性微珠鏈霉親和素-生物素捕獲系統(tǒng),使抗原-抗體反應(yīng)得以在磁性微珠表面快速進(jìn)行,從而大大縮短反應(yīng)時(shí)間(<20分鐘)。反應(yīng)步驟以雙抗夾心法檢測(cè)抗原為例:Ru(bpy)32+標(biāo)記的抗體、包被好的磁珠、待測(cè)樣品共同溫育,形成Ru(bpy)32+-抗體-抗原-抗體-磁性微珠復(fù)合體。然后蠕動(dòng)泵將反應(yīng)液吸入流動(dòng)室,在這里,磁性微珠被工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面,加入TPA,電極加電壓,啟動(dòng)ECL反應(yīng),由光電倍增管檢測(cè)光強(qiáng)度光強(qiáng)度與Ru(bpy)32+的濃度呈線形關(guān)系,據(jù)此可測(cè)出待測(cè)抗原的含量。
2儀器與試劑:
采用德國(guó)Roche公司生產(chǎn)的Elecsys2010全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀及配套試劑。RIA法試劑由中國(guó)原子能科學(xué)研究院提供,γ計(jì)數(shù)儀型號(hào)為西安262T2008P。C-肽試劑由美國(guó)BIOSOURCE公司提供,酶標(biāo)儀是美國(guó)BIORAD生產(chǎn)的550型號(hào)。3標(biāo)本來(lái)源:采自門診和住院已被確診的糖尿病患者,不合并肝腎等急慢性疾患,未用胰島素治療,口服藥物治療者停服磺脲類降糖藥
3天后采血。
將血清置于-20℃冰箱貯存,待測(cè)ECLIA法和RIA法胰島素及ELISA法測(cè)C-肽。結(jié)果:方法學(xué)評(píng)價(jià):
?。?）重復(fù)性實(shí)驗(yàn):取低、中、高三個(gè)濃度的血清,每個(gè)濃度分10份檢測(cè),計(jì)算批內(nèi)誤差,結(jié)果ECLIA批內(nèi)CV為1.97%,RIA批內(nèi)CV為10.18%;用低、中、高三25個(gè)濃度血清3次獨(dú)立試驗(yàn)測(cè)定,每次10份,計(jì)算批間誤差。結(jié)果ECLIA批間CV為2.56%,RIA批間CV為13.21%。
?。?）回收率:取低、中、高三組定值血清,檢測(cè)3次,計(jì)算平均回收率,分別為98.6%、102%、97.7%,平均99.5%。（
3）方法學(xué)比較:用ECLIA法和RIA法分別測(cè)標(biāo)本,將結(jié)果進(jìn)行相關(guān)回歸分析。相關(guān)系數(shù)r=0.987,假設(shè)性檢驗(yàn)P<0.01。
（4）干擾試驗(yàn):取一份定值血清,分別加入不同濃度膽紅素、甘油三酯和血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液,以±10%以內(nèi)作為無(wú)明顯干擾。結(jié)果膽紅素<153μmol/L、甘油三酯<20μmol/L時(shí)無(wú)明顯干擾,溶血使結(jié)果明顯下降。
β細(xì)胞分泌胰島素時(shí)同時(shí)等分子產(chǎn)生C-肽,C-肽在血中半衰期較胰島素長(zhǎng),因此常通過(guò)測(cè)C-肽濃度評(píng)價(jià)β細(xì)胞分泌胰島素的功能。將所有標(biāo)本同時(shí)測(cè)C-肽,分別與ECLIA和RIA法測(cè)定的胰島素結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析。ECLIA法測(cè)得胰島素與C-肽的相關(guān)系數(shù)是0.94,RIA法測(cè)得胰島素與C-肽的相關(guān)系數(shù)是0.91,兩個(gè)相關(guān)系數(shù)的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
討論:
RIA是臨床最常用測(cè)定胰島素的方法,但由于其與胰島素原及胰島素類似物的交叉反應(yīng)高,難以為評(píng)價(jià)胰島β細(xì)胞功能提供準(zhǔn)確的依據(jù),故常同時(shí)測(cè)定C-肽濃度。ECLIA為電促發(fā)光,其結(jié)果穩(wěn)定、靈敏度高、無(wú)放射性污染等問(wèn)題,與其它免疫檢測(cè)手段相比較具有明顯的優(yōu)勢(shì)。ECLIA法測(cè)胰島素與胰島素原的交叉反應(yīng)為0.05%,與糖原、生長(zhǎng)激素?zé)o交叉反應(yīng),與胰島素樣生長(zhǎng)因子交叉反應(yīng)為0.04%,顯示了良好的特異度。溶血標(biāo)本對(duì)測(cè)定結(jié)果影響明顯,采集標(biāo)本時(shí)應(yīng)避免溶血。本文顯示ECLIA法測(cè)定胰島素的各種方法學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)均優(yōu)于RIA法(P<0.01),并且ECLIA法測(cè)定胰島素與C-肽相關(guān)性亦優(yōu)于RIA法(P<0.01),說(shuō)明ECLIA法測(cè)定的胰島素代表了體內(nèi)真正起生物學(xué)作用的胰島素濃度,即真胰島素濃度。由于ECLIA法是目前最快捷的檢測(cè)方法,因此為臨床診治糖尿病提供了更加迅速可靠的證據(jù)。
