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小麥粉中過氧化苯甲酰含量高效液相色譜測定法的建立及其動態變化
發布時間：2017-09-01
經研究，小麥粉增白劑過氧化苯甲酰(又稱“面粉改良劑”)添加到面粉中后，在給面粉增白的同時，還逐漸地被還原為苯甲酸，通常的檢測方法都是采用高效液相色譜法檢測苯甲酸，來達到檢測過氧化苯甲酰的目的。本研究采用甲醇作為提取溶劑，高效液相色譜法同時測定面粉中過氧化苯甲酰和苯甲酸的含量，從而能更加精確地反映小麥粉中的過氧化苯酰含量。該方法樣品前處理簡單，兩種組分分離效果好，無雜峰及拖尾現象，回收率高。同時利用該方法對小麥粉中添加微量過氧化苯甲酰之后，過氧化苯甲酰和苯甲酸含量變化作了進一步的研究。實驗證明，過氧化苯甲酰含量逐漸降低，苯甲酸含量逐漸升高。
一、材料與方法
1.試劑與材料
(1)過氧化苯甲酰標準品:固體，瑞典進口試劑，含量為95%。
(2)苯甲酸標準品:固體，99.95%，德國Dr。
(3)甲醇(色譜純)。
(4)小麥粉。
2.液相色譜分離條件
LC-20AT島津高效液相色譜儀，DGU-20A5在線脫氣機、LC-20AT輸送泵、SIL-20A自動進樣器、CTO20A柱溫箱、SPD-20A紫外檢測器、CBM-20A系統控制器、LC-Solution操作控制系統。
色譜柱:C18 10μm，4mmid×250mm不銹鋼柱(Promsile)。
紫外檢測器:檢測波長235nm。
流動相:流動相A∶流動相B=82∶18。
流動相A:水∶冰醋酸=1000∶1。
流動相B:乙腈∶冰醋酸=1000∶1。
流速:1.2mL?min。
柱溫:40℃。
進樣量:10μL。
3.標準溶液配制
稱取0.1000g左右(本文用到的過氧化苯甲酰標準品的含量為95%，苯甲酸標準品含量為99.5%，折算后過氧化苯甲酰稱取0.1053g，苯甲酸稱取0.1005g)過氧化苯甲酰標準品和苯甲酸標準品，加少量甲醇溶解后用甲醇定容至100mL，配制成1.0000mg/mL的標準儲備液。分別吸取20mL和10mL標準儲備液用甲醇定容至100mL，配制成0.0500mg/mL和0.1000mg/mL的工作液，按照逐級稀釋的原則，分別量取相應的體積將其稀釋后，配制成0.0050mg/mL、0.0125mg/mL、0.0250mg/mL、0.0500mg/mL的標準工作溶液。
4.小麥粉樣品處理及測定
稱量小麥粉樣品5.00g左右，加入甲醇20mL，振蕩器上振蕩30min后，定容至50mL，過濾，取濾液10mL，12000rpm/min離心5min，經過0.45μm過濾頭過濾后，進樣。
5.數據分析
X=(C0×V/m)×0.992+C1×V/m
式中:X――過氧化苯甲酰的含量，g/kg；C0――樣液中苯甲酸質量濃度，mg/mL；V――樣液體積，mL；C1――樣液中過氧化苯甲酰的質量濃度，mg/mL；m――樣品質量，g。
0.992是苯甲酸轉化為過氧化苯甲酰的換算系數。
二、結果與分析
1.色譜分離結果
在上述色譜分離條件下，過氧化苯甲酰和苯甲酸標準溶液能得到很好分離。其中苯甲酸保留時間為3.946min，過氧化苯甲酰保留時間為7.295min，峰形尖銳，無雜峰、拖尾峰、前置峰等現象。處理后的小麥粉樣品峰形較好，樣品出峰處無雜峰干擾。采用外標法定量，苯甲酸及過氧化苯甲酰在(0.005～0.050)mg/mL范圍內有較好的線性關系(見圖1)。R^2=0.9999769。添加回收率表明，過氧化苯甲酰回收率在96.0%～99.3%，苯甲酸回收率為91.3%～95.7%(見表1)。
<CTSM> 圖1 苯甲酸標準工作曲線</CTSM>
<CTSM> 表1 過氧化苯甲酰和苯甲酸添加回收率實驗結果</CTSM>
2.過氧化苯甲酰及其還原產物苯甲酸在小麥粉中含量的動態變化
在1kg面粉中加入60mg過氧化苯甲酰，此時面粉中過氧化苯甲酰為60mg/kg，充分混勻后避光保存。此后8h監控過氧化苯甲酰和苯甲酸的含量變化。每2h取一次樣上機測定二者含量。結果表明，剛加入過氧化苯甲酰的小麥粉中過氧化苯甲酰含量為59.0mg/kg，經過3h的漂白后，過氧化苯甲酰的含量顯著降低為5.6mg/kg，8h后幾乎降為0。而苯甲酸的含量在剛加入過氧化苯甲酰時為5.6mg/kg，3h后增至最高值17.4mg/kg，此后苯甲酸的含量慢慢降低到13.0mg/kg(見圖2)。
<CTSM> 圖2 小麥粉中過氧化苯甲酰和苯甲酸含量的動態變化</CTSM>
三、討論
1.提取劑的選擇
過氧化苯甲酰易溶于苯、乙醚等非極性溶劑，微溶于甲醇，但是苯、乙醚等非極性溶劑溶解過氧化苯甲酰的同時，也會溶解面粉中的其他脂溶性物質，引進大量干擾物，而甲醇極性較大，脂溶性較差，在超聲震蕩的條件下，可以完全快速溶解面粉中添加的少量過氧化苯甲酰，而苯甲酸易溶于甲醇，故本實驗選擇甲醇為提取劑。由于過氧化苯甲酰微溶于甲醇，因此在配制標準溶液時若溶解不充分，非常容易析出，從而造成未能檢出的假象。因此，在配制標準溶液以及小麥粉加入甲醇提取時都要溶解充分后方可定容。
2.檢測波長的選擇
以甲醇溶液作參比，測定過氧化苯甲酰的紫外吸收光譜，結果表明過氧化苯甲酰在(225～238)nm處有較大吸收，考慮到食品中其他成分的影響，選定檢測波長為235nm。
3.流動相的選擇
以水-乙腈溶液為流動相時，過氧化苯甲酰的峰形較好，但苯甲酸無法分離出來，采用加入少量冰醋酸后，過氧化苯甲酰和苯甲酸可以得到較好分離，故選用0.1%冰醋酸水溶液-0.1%冰醋酸乙腈溶液(體積比為82∶18)為流動相作為過氧化苯甲酰和苯甲酸標準色譜分析條件。
4.過氧化苯甲酰的轉化
過氧化苯甲酰由于增白效果明顯，價格便宜，在2011年5月1日前一直是允許添加到小麥粉中起到增白效果，之后便被禁用。過氧化苯甲酰和苯甲酰在加入小麥粉后，在完成增白的同時，本身也轉化為苯甲酸，而過氧化苯甲酰和苯甲酸一個屬于增白劑另一個屬于防腐劑，所以在當時有些小麥粉中檢測出了苯甲酸(防腐劑是不得在小麥粉中添加的)，而企業卻并未曾添加過，原因之一就是過氧化苯甲酰的轉化。
我國目前過氧化苯甲酰的檢測方法主要有氣相法和液相法兩種，均是將小麥粉中的過氧化苯甲酰加入還原劑后還原成為苯甲酸后完成檢測。國標GB22325-2008《小麥粉中過氧化苯甲酰的測定高效液相色譜法》是通過加入50%碘化鉀5mL將過氧化苯甲酰還原為苯甲酸，在筆者看來加入的碘化鉀濃度過高，體積過大。根據以上數據可看出，實際上在檢測時大部分的過氧化苯甲酰已轉化為苯甲酸，加入如此大濃度、大體積的碘化鉀對液相色譜柱的損害極大，并在色譜分離時會在目標物出現之前出現一個超級大峰，不利于目標物的分離。
