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動物源食品中環(huán)丙氨嗪及其代謝物三聚氰胺殘留檢測方法――超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法

發(fā)布時間：2017-09-01

1、安全要求

實驗操作時穿工作服、戴口罩和手套；提取和凈化操作都應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，避免溶劑氣體吸入和皮膚接觸；廢棄的化學(xué)試劑收集到專用容器中集中處理。

2、急救措施

皮膚接觸到有機(jī)溶劑或酸、堿溶液后用清水清洗，有機(jī)溶劑或酸、堿溶液濺入眼中用清水灌洗。

3、適用范圍

該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程適用于雞蛋、雞肉和雞腎中環(huán)丙氨嗪及其代謝物三聚氰胺殘留量的確證檢測。

4、職責(zé)

進(jìn)行該項檢驗的檢驗員必須按該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行檢驗，質(zhì)量監(jiān)督員負(fù)責(zé)監(jiān)督該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的正確執(zhí)行。

5、檢測原理

試料中殘留的環(huán)丙氨嗪及代謝物三聚氰胺用3％三氯乙酸溶液提取，MCX固相萃取柱凈化后，過濾膜用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，外標(biāo)法定量。

6、方法靈敏度

環(huán)丙氨嗪及其代謝物三聚氰胺在雞蛋、雞肉和雞腎中的檢測限lμg/kg，定量限為2.5μg/kg。

7、注意事項

過柱凈化時上樣、淋洗、洗脫的流速保持在l～2mL/min。

8、材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求

除特別注明外，以下所用試劑均為分析純；水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。

8.1 環(huán)丙氨嗪及三聚氰胺對照品、試劑和藥物儲備液、工作液準(zhǔn)備

8.1.1 環(huán)丙氨嗪對照品含C_{6H_{10N_{6不得少于98.0％}}}

8.1.2三聚氰胺對照品含C_{3H_{6N_{6不得少于98.0％}}}

8.1.3三氯乙酸

8.1.4乙腈色譜純

8.1.5甲醇色譜純

8.1.6甲酸

8.1.7 乙酸銨

8.1.8 3％三氯乙酸溶液稱取3g三氯乙酸，用水溶解并稀釋至lOOmL，混勻即得。

8.1.9 2％甲酸水溶液量取2mL甲酸，用水稀釋至100mL，混勻即得。

8.1.10 5％氨化甲醇溶液量取5mL氨水，用甲醇稀釋至lOOmL，混勻即得。

8.1.11 乙酸銨溶液(0.01mmol/L) 取乙酸銨0.8g，加水溶解并稀釋至1000mL，即得。

8.1.12標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1mg/mL) 精確稱取環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺對照品各約10mg，置10mL棕色量瓶中，用50％乙腈水溶液溶解并稀釋成濃度為lmg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。4^{0C下保存，有效期為3個月。}

8.1.13 1μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液精確量取lmg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1mL，置10mL棕色量瓶中，用乙腈稀釋成含環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液；從中精密量取0.1mL，置于10mL量瓶內(nèi)，用甲醇稀釋至刻度，即得lOOng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。4℃下保存，有效期為3個月。

8.2儀器和設(shè)備

8.2.1 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)

8.2.2天平感量0.01g

8.2.3分析天平感量0.00001g

8.2.4固相萃取裝置(配真空泵)

8.2.5樣品濃縮器

8.2.6渦旋混合器

8.2.7振蕩器

8.2.8離心機(jī)

8.2.9雞心瓶50mL

8.2.10離心管15mL

8.2.11固相萃取柱Oasis HLB小柱(60mg/3mL)，或相當(dāng)者

8.2.12微孔濾頭0.45μm

9、檢驗步驟

9.1試料的制備

9.1.1 取新鮮或解凍的供試樣品，作為供試試料。

9.1.2取新鮮或解凍的空白樣品(2±0.02)g，作為空白試料(陰性對照)。

9．1．3取新鮮或解凍的空白樣品(2±0.02)g，添加lOOng/mL的混合對照溶液0.2mL，作為空白添加試料(陽性對照)。

9.2提取

9.2.1 準(zhǔn)確稱取(2±0.02)g試料，置50mL離心管內(nèi)，加3％三氯乙酸溶液18mL，渦旋混合30s，超聲提取10min。

9.2.2取出離心管靜置10min，10000r/min離心10min，將上層溶液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，備用。

9.3凈化

9.3.1 固相萃取柱依次用甲醇、水各3mL預(yù)洗活化。

9.3.2取備用液lOmL過柱，用2％甲酸水溶液、甲醇各3mL淋洗，真空抽干。

9.3.3用5％氨化甲醇溶液3mL洗脫，真空抽干，收集洗脫液。洗脫液于50℃下氮氣吹干，殘余物用95％乙腈水溶液1.OmL溶解，渦旋混勻，過濾膜后，供超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

9.4測定

9.4.1 色譜條件

9.4.1.1色譜柱：BEH HILIC色譜柱(50mm×2.1mm，1.7μm)，或相當(dāng)者；

9.4.1.2柱溫：30％：；

9.4.1.3進(jìn)樣量：10μL；

9.4.1.4流動相A：乙腈；

流動相B：0.01tool/L乙酸銨溶液；

流動相梯度洗脫條件見表1。

9.4.2 質(zhì)譜條件

9.4.2.1 離子源參考參數(shù)見表2。

9.4.2.2質(zhì)量分析器參考參數(shù)見表3。

9.4.2.3光電倍增器電壓：650V。

9.4.2.4定性、定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量見表4。

9.5檢測數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制

9.5.1線性考察

準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)工作液，用初始比例流動相稀釋成濃度均為2.5ng/mL、5 ng/mL、10ng/mL、20ng/mL mL、50ng/mL、100ng/mL的系列混合對照溶液，量取6種濃度的混合對照溶液各1.OmL，分別用于溶解預(yù)先按提取凈化吹干后的殘余物，渦旋混勻，過濾膜后作為基質(zhì)匹配系列混合對照溶液，從低濃度到高濃度測定，每一濃度進(jìn)樣3針，以峰面積與相應(yīng)對照溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

9.5.2空白試驗和添加試驗空白試料、基質(zhì)匹配陽性添加的提取和凈化采用與樣品相同的方法操作。對照溶液、基質(zhì)匹配陽性添加試料得到的特征離子的質(zhì)量色譜圖分別見附錄中圖1、圖2、圖3和圖4。

9.5.3序列表的編制

試劑空白進(jìn)1針；

樣品空白進(jìn)2針；

對照溶液進(jìn)3針，其RSD<10％；

樣品1―1進(jìn)l針；

樣品1―2進(jìn)1針；

…………

樣品4一l進(jìn)1針；

樣品4―2進(jìn)1針；

陽性添加各進(jìn)1針；

對照溶液進(jìn)2針；

……………

(注：順序的任何調(diào)整應(yīng)有充分理由讓明其合理性)

9.5.4定性需同時滿足下列條件：

9.5.4.1試劑空白和樣品空白不能出現(xiàn)與陽性對照相同的離子峰。

9.5.4.2所有離子色譜峰的信噪比(S/N)都在3∶1以上，信噪比以峰對峰(PtP)計算。

9．5．4．3試樣色譜峰的保留時間，應(yīng)與校正溶液的保留時間一致，容許偏差為±2．5％。

9.5.4.4試樣溶液中的離子豐度比應(yīng)與校正溶液的一致，容許偏差符合表5的要求。

9.5.5定量方法

采用基質(zhì)匹配單點校準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)，按外標(biāo)法以峰面積計算，即得。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)時試樣溶液及對照溶液中環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺的峰面積均應(yīng)在儀器檢測線性范圍之內(nèi)。

9.6記錄與計算

9.6.1記錄項目

9.6.1.1逐項填寫中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所“檢驗記錄”首頁。

9.6.1.2對照品名稱、來源、批號、含量。

9.6.1.3儲備液、工作液及對照溶液制備及制備日期。

9.6.1.4試料制備、提取、凈化、測定(包括測定過程中涉及的計量儀器編號)。

9.6.1.5原始數(shù)據(jù)(包括儀器測定圖譜和打印的數(shù)據(jù))。

9.6.1.6計算公式及計算過程(軟件計算除外)。

9.6.2計算

按下式計算試料中環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺的殘留量：