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骨轉(zhuǎn)換相關(guān)標(biāo)志物檢測
發(fā)布時間：2017-09-01
反映骨形成的生化指標(biāo)有總堿性磷酸酶、骨源性堿性磷酸酶、骨鈣素和I型前膠原羧基端/氨基端前肽(PICP/PINP)等。
(一)骨形成標(biāo)志物的檢測
1．骨鈣素(BGP)測定 測定BGP的方法主要為免疫標(biāo)記法，如放射免疫法、雙位免疫放射法、酶聯(lián)免疫法、親和素-生物素酶免疫測定法(BAEIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、免疫熒光分析法等。目前應(yīng)用最多的是放射免疫法和化學(xué)發(fā)光免疫分析法。
【檢測方法】
(1)放射免疫法：用碘125I標(biāo)記骨鈣素和未標(biāo)記的骨鈣素對限量的特異性抗體競爭結(jié)合反應(yīng)。具體同降鈣素放射免疫法原理。
(2)化學(xué)發(fā)光免疫分析法：采用雙抗體夾心法原理，將標(biāo)本、生物素化的抗N-MID骨鈣素單克隆抗體和發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的抗N-MID骨鈣素單克隆抗體混勻，形成夾心復(fù)合物。加入鏈霉素親和素包被的微粒，使形成的復(fù)合物結(jié)合到微粒上。經(jīng)過孵育后形成抗原一抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌分離復(fù)合物與游離物，復(fù)合物在激發(fā)發(fā)光劑的作用下分解發(fā)光，測定復(fù)合物的發(fā)光強度，得到BGP的濃度。
【參考區(qū)間】放射免疫法：成人(4.75 4±1.33)μg/L。化學(xué)發(fā)光免疫分析法：成年男性：14.0-70μg/L；絕經(jīng)前婦女：11.0-43μg/L；絕經(jīng)后婦女：15.0-46μg/L。每個實驗室均應(yīng)制訂自己的正常參考值。
【臨床意義】骨鈣素升高見于兒童生長期、腎性骨營養(yǎng)不良、畸形性骨炎、甲狀旁腺功能亢進、甲狀腺功能亢進、骨折、骨轉(zhuǎn)移癌、低磷血癥、腎功能不全等。老年性骨質(zhì)疏松癥可有輕度升高。高轉(zhuǎn)換率的骨質(zhì)疏松患者，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松BGP升高明顯，雌激素治療2～8周后BGP下降50％以上。骨鈣素降低見于甲狀旁腺功能減退、甲狀腺功能減退、肝病、長期應(yīng)用腎上腺皮質(zhì)激素治療等。
【方法評價】
放射免疫法：分析靈敏度小于1μg/L，線性范圍為1～16μg/L，其不足之處在于不能鑒別所測定的降鈣素是否具有生物學(xué)活性。該方法精
密度：批內(nèi)CV為2.6％～4.7％，批問CV為5.7％～7.4％，回收率為(96.8土5.5)％。125I物理半衰期(t1/2)為60天。
(2)化學(xué)發(fā)光免疫分析法：受溶血干擾，血細(xì)胞含有的蛋白酶可分解骨鈣素，不受黃疸(膽紅素<112μmol/L)干擾。線性范圍為0．50～300μg/L，分析靈敏度為0.50μg/L，本法精
密度：批內(nèi)CV為1.2％～4.0％，批間CV為1.7％～6.5％。
2．骨性堿性磷酸酶(B-ALP)測定 測定B-ALP的主要設(shè)計原理是采用物理、化學(xué)或生物學(xué)方法先識別或分離出B-ALP，再測定其堿性磷酸酶的活性。熱失活法、化學(xué)抑制法、電泳法、等電聚焦法、麥胚凝集素法(wheat germ agglutinin，WGA)以及高效液相色譜法(HPLC)都可用于檢測B-ALP。近來建立了對B-ALP特異性很強的單克隆抗體的免疫分析法，具有高度的特異性和敏感性，而且操作簡便，是目前鑒別和定量分析B-ALP的最佳方法。
【檢測方法】
(1)免疫活性測定法：將抗-B-ALP包被在固相載體上，加入被檢標(biāo)本，抗原ALP與抗體特異性結(jié)合，洗滌其他ALP同工酶，與抗體結(jié)合的B-ALP催化對硝基酚磷酸二鈉，用酶標(biāo)儀405nm比色檢測對硝基酚的生成量，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得B-ALP的活性。 ．
(2)酶聯(lián)免疫法：血清中的B-ALP與結(jié)合物(含有生物素標(biāo)記的特異性骨性堿性磷酶單克隆抗體)結(jié)合，此結(jié)合物同時又與包被在孔壁上的鏈霉素親和素反應(yīng)，形成鏈霉素親和素-生物素標(biāo)記的特異性骨性堿性磷酸酶單克隆抗體-B-ALP復(fù)合物。經(jīng)洗滌除去未能形成復(fù)合物的其他物質(zhì)，再加入酶作用的底物。底物的消耗量與B-ALP的含量成正比，通過與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)品進行比較即可求出血清中B-ALP的含量。
【參考區(qū)間】
(1)免疫活性測定法：成年男性為(24.9土7.0)U/L；成年女性為(19.7士5.6)U/L。
(2)酶聯(lián)免疫法：成年男性為(1213士4．3)ug／L，絕經(jīng)前婦女為(8．7士2．9)Jtg／I。，絕經(jīng)后婦女為(13.2土4.7) μg/L，各實驗室應(yīng)建立起自己的參考區(qū)間。
【臨床意義】堿性磷酸酶活性降低極少見，多數(shù)均為骨性堿性磷酸酶增高。血清堿性磷酸酶和骨性堿性磷酸酶增高見于甲狀腺功能亢進、甲狀旁腺功能亢進、骨轉(zhuǎn)移癌、佝僂病、軟骨病、骨折、畸形性骨炎、氟骨癥、高骨轉(zhuǎn)換型的骨質(zhì)疏松患者[如絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松癥(老年骨質(zhì)疏松癥形成緩慢，ALP變化不顯著)]。發(fā)生肝膽疾病時，血清總堿性磷酸酶升高，骨性堿性磷酸酶正常。絕經(jīng)期后堿性磷酸酶增高，但不超過正常值的1倍。骨性堿性磷酸酶也可用于骨轉(zhuǎn)移癌患者的病程和治療效果的監(jiān)測。
【方法評價】免疫分析法具有較好的靈敏度、重復(fù)性，易于在臨床實驗室推廣，是目前定量分析B-ALP最常用的方法。但目前免疫法存在的主要不足是抗B-ALP抗體特異性不高，與肝性ALP存在5％～20%的交叉反應(yīng)。本法精
密度：批內(nèi)CV為3．9％～9．5％，批間CV為4.4％～10.0％。檢測靈敏度<1.0μg/L。線性范圍為7～90μg/L。
3．I型前膠原羧基端前肽和I型前膠原氨基端前肽的測定 目前PINP和PICP測定方法主要采用放射免疫法、酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光法。血清中的PINP以高分子量和低分子量兩種形式存在，制備抗PNPa1，鏈的抗體建立的免疫標(biāo)記法是測定：PINP的主要方法。
【檢測方法】
(1)RIA法：目前市售的放射免疫試劑盒，均是針對PINPa1鏈的特異抗體，只能檢測P1NP的高分子量型。基本原理同骨鈣素放射免疫法測定。
(2)化學(xué)發(fā)光免疫分析法：同骨鈣素測定。
【參考區(qū)間】
(1)放射免疫法：男性為38-202μg/L；女性為50-170μg/L。
(2)化學(xué)發(fā)光法：成人男性為20-40μg/L；絕經(jīng)前女性為20-40μg/L；絕經(jīng)后女性為20～70μg/L。
【臨床意義】PINP增高見于：①兒童發(fā)育期，正常兒童血清PINP含量平均為正常成人的2倍；②妊娠最后3個月；③骨腫瘤和腫瘤的骨轉(zhuǎn)移，特別是前列腺癌骨轉(zhuǎn)移、乳腺癌骨轉(zhuǎn)移；④其他：畸形性骨炎、酒精性肝炎、肺纖維化等。PINP降低見于絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松患者經(jīng)雌激素治療6個月后PINP可降低30％(雌激素對骨代謝的影響可通過測定PINP的濃度進行評價，但其降低的機制尚不清楚)。
【方法評價】
(1)放射免疫法：精
密度：批內(nèi)CV為3.1％，批間CV為3．9％，平均回收率為106．1％，最低檢測限為2μg/L。
(2)化學(xué)發(fā)光法：檢測結(jié)果不受黃疸(膽紅素<1112μmol/L)、溶血(血紅蛋白<1.1mmol/L)、脂血(甘油三酯<17mol/L)的影響。回收率在(100±10)％之內(nèi)。分析靈敏度<5μg／L，精
密度：批內(nèi)CV為1.8％～2.2％，批問CV為2.3％～3.7％，檢測線性范圍為5～1200μg／L。
(二)骨吸收標(biāo)志物測定
反映骨吸收的生化指標(biāo)主要有血抗酒石酸酸性磷酸酶、尿羥脯氨酸、尿羥賴氨酸糖苷、尿中膠原吡啶交聯(lián)，I型膠原羧基端/氨基末端肽等。
1、吡啶酚和脫氧吡啶酚測定 吡啶酚和脫氧吡啶酚的測定方法有紙層析法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法和放射免疫法。
【檢測方法】酶聯(lián)免疫法：用純化的多克隆抗體包被微孔板，制成固相載體，加入標(biāo)本、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度，計算樣品濃度。采用測定尿中游離吡啶交聯(lián)(Pyr/D-Pyr)，同時測定尿中肌酐，求兩者的比值。
【參考區(qū)間】Pyr/Cr：男性13.6～25.8nmol/mmol；女性(絕經(jīng)前)16.3～31.9mmol/mmol。D-Pyr/Cr：男性22.0～38.5nmol/mmol；女性3.0-7.4nmol/mmol。
【臨床意義】吡啶酚水平評價已用于骨質(zhì)疏松、Paget病、其他代謝性骨病、原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進和甲狀腺功能亢進，以及其他伴有骨吸收增加的疾病的診斷或病情評價。絕經(jīng)后婦女與絕經(jīng)前比較，Pyr和D-Pyr通常比其他吸收和形成標(biāo)志物增高明顯，如果絕經(jīng)后婦女或骨質(zhì)疏松癥用二磷酸鹽或雌激素治療，Pyr和D-Pyr會降低。
【方法評價】Pyr精
密度：批內(nèi)CV為4.4％～7％，批問CV為4.6％～10.8％，回收率為94.8％-99.6％。D-Pvr時，精
密度：批內(nèi)CV為4．4％～7％，批間CV為4．6％～10.8％，回收率為96％～106％。
2、I型膠原C端肽和N端肽測定 I型膠原C端肽和N端肽測定方法有紙層析法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法和放射免疫法。
(1)CTX
【檢測方法】 I型膠原C端肽(CTX)采用酶聯(lián)免疫法，用純化的CTX抗體包被微孔板，制成固相載體，向微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的CTX抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物(TMB)顯色。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人CTX的濃度。
【參考區(qū)間】實驗室應(yīng)建立自己的參考區(qū)問。
【臨床意義】交聯(lián)C端肽水平的評價可用于骨質(zhì)疏松、Paget病、其他代謝性骨病、原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進和甲狀腺功能亢進以及其他伴有骨吸收增加性疾病的診斷或病情評價。
【方法評價】精
密度：批內(nèi)平均CV為4.4％，批問平均CV為5.3％。線性范圍為25～800μg/L。
(2)尿液中的NTX
【檢測方法】采用競爭抑制酶聯(lián)免疫法(ELISA法)，用NTX包被微孔板，標(biāo)本中的NTX和微孔板的NTX競爭與HRP標(biāo)記的I型膠原N端肽(NTX)抗體結(jié)合，標(biāo)本中的NTX的含量與微孔板上結(jié)合的抗體量成反比，微孔板經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色，顏色的深淺和樣品中的NTX呈負(fù)相關(guān)。可同時測定尿中肌酐，求兩者的比值。
【參考區(qū)間】NTX/Cr：男性為3.0～63nmol/mmol；女性(絕經(jīng)前)為5.0～65nmol/mmol；女性(絕經(jīng)后)為6.0～74nmol/mmol。
【臨床意義】同CTX。
【方法評價】精
密度：批內(nèi)CV為5％～8％，批問CV為7％～10％。回收率平均為105%，線性范圍為3.0～500nmol/mmol。
3．抗酒石酸酸性磷酸酶測定 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)測定方法有酶動力學(xué)法、電泳法、放射免疫法和酶聯(lián)免疫法等。
【檢測方法】
(1)酶動力學(xué)法：以L-酒石酸鈉作為抑制劑，以4-硝基苯磷酸鹽為底物測定酶活性。
(2)酶聯(lián)免疫法：用純化的TRAP抗體包被微孔板，制成固相載體，向微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，TRAP與孔內(nèi)包被的抗TRAP單克隆抗體結(jié)合。加入底物pNPP溫育，顏色的深淺和樣品中的TRAP呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在405nm處測定吸光度，計算樣品濃度。
【參考區(qū)間】
(1)酶動力學(xué)法：成人血漿3.1～5.4U/L。
(2)酶聯(lián)免疫法：男性血清為22～54U/L，健康絕經(jīng)前婦女為22～54U/L，健康老人為55～79U/L。
【臨床意義】增高見于原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進、慢性。腎功能不全、畸形性骨炎、骨轉(zhuǎn)移癌、卵巢切除術(shù)后、高轉(zhuǎn)換率的骨質(zhì)疏松患者。降低見于骨吸收降低的疾病，如甲狀旁腺功能降低。老年性骨質(zhì)疏松癥患者TRAP增高不顯著。
【方法評價】
(1)酶動力學(xué)法：靈敏度為0.1u/L，精
密度：批內(nèi)變異CV<6.5%，批問變異CV<8％。
(2)酶聯(lián)免疫法：純化的TRAP抗體不能完全識別骨性TRAP，因此敏感性受影響。結(jié)果在參考值范圍之內(nèi)，不能完全排除骨代謝沒有異常，因此，所有結(jié)果應(yīng)該結(jié)合臨床數(shù)據(jù)和其他診斷指標(biāo)來解釋。檢測靈敏度為0.5～10U/L，精
密度：批內(nèi)CV為6.0％，批問CV為9.2％，回收率為100.9%，高濃度脂血有可能降低吸光度，干擾檢測結(jié)果。
4．尿HOP常用的有氯胺T化學(xué)法、離子交換色譜法和反相高效液相色譜法等。一般采用氯胺T化學(xué)法。
【檢測方法】氯胺T化學(xué)法：尿中與肽結(jié)合的羥脯氨酸，經(jīng)酸水解后釋出。用氯胺T(N-氯-對甲基苯磺酰胺鈉)將羥脯氨酸氧化，使其形成含吡咯環(huán)的氧化物。再用過氯酸破壞多余的氯胺T，終止氧化過程。同時，使氧化物與對二甲氨基苯甲醛反應(yīng)，生成紅色化合物進行比色定量。一般檢測空腹晨尿、空腹2小時尿HOP，及與Cr的比值、24小時尿：HOP等。
【參考區(qū)間】清晨第二次空腹尿，尿羥脯氨酸與肌酐的比值(HOP/Cr)的參考區(qū)間為0.06～0.016。24小時尿HOP測定的參考區(qū)間為114～300μmol/24h。
【臨床意義】增加見于各種骨代謝性疾病，如Paget病、骨軟化癥，骨腫瘤等。嚴(yán)重骨折患者尿中也可增加。兒童生長期、甲狀旁腺功能亢進、甲狀腺功能亢進、骨轉(zhuǎn)移癌、慢性腎功能不全、畸形性骨炎、高轉(zhuǎn)換的骨質(zhì)疏松癥患者、佝僂病和軟骨病，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥等HOP升高。降低見于甲狀腺功能低下、侏儒癥等。老年性骨質(zhì)疏松癥HOP的變化不顯著。
【方法評價】此法不特異，受飲食影響較大，收集24小時尿之前，應(yīng)素食2～3天。
參考資料：骨代謝異常的生物化學(xué)檢驗
