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骨轉(zhuǎn)換相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè)
發(fā)布時(shí)間：2017-09-01
反映骨形成的生化指標(biāo)有總堿性磷酸酶、骨源性堿性磷酸酶、骨鈣素和I型前膠原羧基端/氨基端前肽(PICP/PINP)等。
(一)骨形成標(biāo)志物的檢測(cè)
1．骨鈣素(BGP)測(cè)定 測(cè)定BGP的方法主要為免疫標(biāo)記法，如放射免疫法、雙位免疫放射法、酶聯(lián)免疫法、親和素-生物素酶免疫測(cè)定法(BAEIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、免疫熒光分析法等。目前應(yīng)用最多的是放射免疫法和化學(xué)發(fā)光免疫分析法。
【檢測(cè)方法】
(1)放射免疫法：用碘125I標(biāo)記骨鈣素和未標(biāo)記的骨鈣素對(duì)限量的特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)。具體同降鈣素放射免疫法原理。
(2)化學(xué)發(fā)光免疫分析法：采用雙抗體夾心法原理，將標(biāo)本、生物素化的抗N-MID骨鈣素單克隆抗體和發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的抗N-MID骨鈣素單克隆抗體混勻，形成夾心復(fù)合物。加入鏈霉素親和素包被的微粒，使形成的復(fù)合物結(jié)合到微粒上。經(jīng)過(guò)孵育后形成抗原一抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌分離復(fù)合物與游離物，復(fù)合物在激發(fā)發(fā)光劑的作用下分解發(fā)光，測(cè)定復(fù)合物的發(fā)光強(qiáng)度，得到BGP的濃度。
【參考區(qū)間】放射免疫法：成人(4.75 4±1.33)μg/L。化學(xué)發(fā)光免疫分析法：成年男性：14.0-70μg/L；絕經(jīng)前婦女：11.0-43μg/L；絕經(jīng)后婦女：15.0-46μg/L。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室均應(yīng)制訂自己的正常參考值。
【臨床意義】骨鈣素升高見(jiàn)于兒童生長(zhǎng)期、腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良、畸形性骨炎、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、甲狀腺功能亢進(jìn)、骨折、骨轉(zhuǎn)移癌、低磷血癥、腎功能不全等。老年性骨質(zhì)疏松癥可有輕度升高。高轉(zhuǎn)換率的骨質(zhì)疏松患者，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松BGP升高明顯，雌激素治療2～8周后BGP下降50％以上。骨鈣素降低見(jiàn)于甲狀旁腺功能減退、甲狀腺功能減退、肝病、長(zhǎng)期應(yīng)用腎上腺皮質(zhì)激素治療等。
【方法評(píng)價(jià)】
放射免疫法：分析靈敏度小于1μg/L，線性范圍為1～16μg/L，其不足之處在于不能鑒別所測(cè)定的降鈣素是否具有生物學(xué)活性。該方法精
密度：批內(nèi)CV為2.6％～4.7％，批問(wèn)CV為5.7％～7.4％，回收率為(96.8土5.5)％。125I物理半衰期(t1/2)為60天。
(2)化學(xué)發(fā)光免疫分析法：受溶血干擾，血細(xì)胞含有的蛋白酶可分解骨鈣素，不受黃疸(膽紅素<112μmol/L)干擾。線性范圍為0．50～300μg/L，分析靈敏度為0.50μg/L，本法精
密度：批內(nèi)CV為1.2％～4.0％，批間CV為1.7％～6.5％。
2．骨性堿性磷酸酶(B-ALP)測(cè)定 測(cè)定B-ALP的主要設(shè)計(jì)原理是采用物理、化學(xué)或生物學(xué)方法先識(shí)別或分離出B-ALP，再測(cè)定其堿性磷酸酶的活性。熱失活法、化學(xué)抑制法、電泳法、等電聚焦法、麥胚凝集素法(wheat germ agglutinin，WGA)以及高效液相色譜法(HPLC)都可用于檢測(cè)B-ALP。近來(lái)建立了對(duì)B-ALP特異性很強(qiáng)的單克隆抗體的免疫分析法，具有高度的特異性和敏感性，而且操作簡(jiǎn)便，是目前鑒別和定量分析B-ALP的最佳方法。
【檢測(cè)方法】
(1)免疫活性測(cè)定法：將抗-B-ALP包被在固相載體上，加入被檢標(biāo)本，抗原ALP與抗體特異性結(jié)合，洗滌其他ALP同工酶，與抗體結(jié)合的B-ALP催化對(duì)硝基酚磷酸二鈉，用酶標(biāo)儀405nm比色檢測(cè)對(duì)硝基酚的生成量，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得B-ALP的活性。 ．
(2)酶聯(lián)免疫法：血清中的B-ALP與結(jié)合物(含有生物素標(biāo)記的特異性骨性堿性磷酶單克隆抗體)結(jié)合，此結(jié)合物同時(shí)又與包被在孔壁上的鏈霉素親和素反應(yīng)，形成鏈霉素親和素-生物素標(biāo)記的特異性骨性堿性磷酸酶單克隆抗體-B-ALP復(fù)合物。經(jīng)洗滌除去未能形成復(fù)合物的其他物質(zhì)，再加入酶作用的底物。底物的消耗量與B-ALP的含量成正比，通過(guò)與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較即可求出血清中B-ALP的含量。
【參考區(qū)間】
(1)免疫活性測(cè)定法：成年男性為(24.9土7.0)U/L；成年女性為(19.7士5.6)U/L。
(2)酶聯(lián)免疫法：成年男性為(1213士4．3)ug／L，絕經(jīng)前婦女為(8．7士2．9)Jtg／I。，絕經(jīng)后婦女為(13.2土4.7) μg/L，各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立起自己的參考區(qū)間。
【臨床意義】堿性磷酸酶活性降低極少見(jiàn)，多數(shù)均為骨性堿性磷酸酶增高。血清堿性磷酸酶和骨性堿性磷酸酶增高見(jiàn)于甲狀腺功能亢進(jìn)、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、骨轉(zhuǎn)移癌、佝僂病、軟骨病、骨折、畸形性骨炎、氟骨癥、高骨轉(zhuǎn)換型的骨質(zhì)疏松患者[如絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松癥(老年骨質(zhì)疏松癥形成緩慢，ALP變化不顯著)]。發(fā)生肝膽疾病時(shí)，血清總堿性磷酸酶升高，骨性堿性磷酸酶正常。絕經(jīng)期后堿性磷酸酶增高，但不超過(guò)正常值的1倍。骨性堿性磷酸酶也可用于骨轉(zhuǎn)移癌患者的病程和治療效果的監(jiān)測(cè)。
【方法評(píng)價(jià)】免疫分析法具有較好的靈敏度、重復(fù)性，易于在臨床實(shí)驗(yàn)室推廣，是目前定量分析B-ALP最常用的方法。但目前免疫法存在的主要不足是抗B-ALP抗體特異性不高，與肝性ALP存在5％～20%的交叉反應(yīng)。本法精
密度：批內(nèi)CV為3．9％～9．5％，批間CV為4.4％～10.0％。檢測(cè)靈敏度<1.0μg/L。線性范圍為7～90μg/L。
3．I型前膠原羧基端前肽和I型前膠原氨基端前肽的測(cè)定 目前PINP和PICP測(cè)定方法主要采用放射免疫法、酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光法。血清中的PINP以高分子量和低分子量?jī)煞N形式存在，制備抗PNPa1，鏈的抗體建立的免疫標(biāo)記法是測(cè)定：PINP的主要方法。
【檢測(cè)方法】
(1)RIA法：目前市售的放射免疫試劑盒，均是針對(duì)PINPa1鏈的特異抗體，只能檢測(cè)P1NP的高分子量型。基本原理同骨鈣素放射免疫法測(cè)定。
(2)化學(xué)發(fā)光免疫分析法：同骨鈣素測(cè)定。
【參考區(qū)間】
(1)放射免疫法：男性為38-202μg/L；女性為50-170μg/L。
(2)化學(xué)發(fā)光法：成人男性為20-40μg/L；絕經(jīng)前女性為20-40μg/L；絕經(jīng)后女性為20～70μg/L。
【臨床意義】PINP增高見(jiàn)于：①兒童發(fā)育期，正常兒童血清PINP含量平均為正常成人的2倍；②妊娠最后3個(gè)月；③骨腫瘤和腫瘤的骨轉(zhuǎn)移，特別是前列腺癌骨轉(zhuǎn)移、乳腺癌骨轉(zhuǎn)移；④其他：畸形性骨炎、酒精性肝炎、肺纖維化等。PINP降低見(jiàn)于絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松患者經(jīng)雌激素治療6個(gè)月后PINP可降低30％(雌激素對(duì)骨代謝的影響可通過(guò)測(cè)定PINP的濃度進(jìn)行評(píng)價(jià)，但其降低的機(jī)制尚不清楚)。
【方法評(píng)價(jià)】
(1)放射免疫法：精
密度：批內(nèi)CV為3.1％，批間CV為3．9％，平均回收率為106．1％，最低檢測(cè)限為2μg/L。
(2)化學(xué)發(fā)光法：檢測(cè)結(jié)果不受黃疸(膽紅素<1112μmol/L)、溶血(血紅蛋白<1.1mmol/L)、脂血(甘油三酯<17mol/L)的影響。回收率在(100±10)％之內(nèi)。分析靈敏度<5μg／L，精
密度：批內(nèi)CV為1.8％～2.2％，批問(wèn)CV為2.3％～3.7％，檢測(cè)線性范圍為5～1200μg／L。
(二)骨吸收標(biāo)志物測(cè)定
反映骨吸收的生化指標(biāo)主要有血抗酒石酸酸性磷酸酶、尿羥脯氨酸、尿羥賴氨酸糖苷、尿中膠原吡啶交聯(lián)，I型膠原羧基端/氨基末端肽等。
1、吡啶酚和脫氧吡啶酚測(cè)定 吡啶酚和脫氧吡啶酚的測(cè)定方法有紙層析法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法和放射免疫法。
【檢測(cè)方法】酶聯(lián)免疫法：用純化的多克隆抗體包被微孔板，制成固相載體，加入標(biāo)本、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物TMB顯色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品濃度。采用測(cè)定尿中游離吡啶交聯(lián)(Pyr/D-Pyr)，同時(shí)測(cè)定尿中肌酐，求兩者的比值。
【參考區(qū)間】Pyr/Cr：男性13.6～25.8nmol/mmol；女性(絕經(jīng)前)16.3～31.9mmol/mmol。D-Pyr/Cr：男性22.0～38.5nmol/mmol；女性3.0-7.4nmol/mmol。
【臨床意義】吡啶酚水平評(píng)價(jià)已用于骨質(zhì)疏松、Paget病、其他代謝性骨病、原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)和甲狀腺功能亢進(jìn)，以及其他伴有骨吸收增加的疾病的診斷或病情評(píng)價(jià)。絕經(jīng)后婦女與絕經(jīng)前比較，Pyr和D-Pyr通常比其他吸收和形成標(biāo)志物增高明顯，如果絕經(jīng)后婦女或骨質(zhì)疏松癥用二磷酸鹽或雌激素治療，Pyr和D-Pyr會(huì)降低。
【方法評(píng)價(jià)】Pyr精
密度：批內(nèi)CV為4.4％～7％，批問(wèn)CV為4.6％～10.8％，回收率為94.8％-99.6％。D-Pvr時(shí)，精
密度：批內(nèi)CV為4．4％～7％，批間CV為4．6％～10.8％，回收率為96％～106％。
2、I型膠原C端肽和N端肽測(cè)定 I型膠原C端肽和N端肽測(cè)定方法有紙層析法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法和放射免疫法。
(1)CTX
【檢測(cè)方法】 I型膠原C端肽(CTX)采用酶聯(lián)免疫法，用純化的CTX抗體包被微孔板，制成固相載體，向微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的CTX抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物(TMB)顯色。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人CTX的濃度。
【參考區(qū)間】實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立自己的參考區(qū)問(wèn)。
【臨床意義】交聯(lián)C端肽水平的評(píng)價(jià)可用于骨質(zhì)疏松、Paget病、其他代謝性骨病、原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)和甲狀腺功能亢進(jìn)以及其他伴有骨吸收增加性疾病的診斷或病情評(píng)價(jià)。
【方法評(píng)價(jià)】精
密度：批內(nèi)平均CV為4.4％，批問(wèn)平均CV為5.3％。線性范圍為25～800μg/L。
(2)尿液中的NTX
【檢測(cè)方法】采用競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫法(ELISA法)，用NTX包被微孔板，標(biāo)本中的NTX和微孔板的NTX競(jìng)爭(zhēng)與HRP標(biāo)記的I型膠原N端肽(NTX)抗體結(jié)合，標(biāo)本中的NTX的含量與微孔板上結(jié)合的抗體量成反比，微孔板經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色，顏色的深淺和樣品中的NTX呈負(fù)相關(guān)。可同時(shí)測(cè)定尿中肌酐，求兩者的比值。
【參考區(qū)間】NTX/Cr：男性為3.0～63nmol/mmol；女性(絕經(jīng)前)為5.0～65nmol/mmol；女性(絕經(jīng)后)為6.0～74nmol/mmol。
【臨床意義】同CTX。
【方法評(píng)價(jià)】精
密度：批內(nèi)CV為5％～8％，批問(wèn)CV為7％～10％。回收率平均為105%，線性范圍為3.0～500nmol/mmol。
3．抗酒石酸酸性磷酸酶測(cè)定 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)測(cè)定方法有酶動(dòng)力學(xué)法、電泳法、放射免疫法和酶聯(lián)免疫法等。
【檢測(cè)方法】
(1)酶動(dòng)力學(xué)法：以L-酒石酸鈉作為抑制劑，以4-硝基苯磷酸鹽為底物測(cè)定酶活性。
(2)酶聯(lián)免疫法：用純化的TRAP抗體包被微孔板，制成固相載體，向微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，TRAP與孔內(nèi)包被的抗TRAP單克隆抗體結(jié)合。加入底物pNPP溫育，顏色的深淺和樣品中的TRAP呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在405nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品濃度。
【參考區(qū)間】
(1)酶動(dòng)力學(xué)法：成人血漿3.1～5.4U/L。
(2)酶聯(lián)免疫法：男性血清為22～54U/L，健康絕經(jīng)前婦女為22～54U/L，健康老人為55～79U/L。
【臨床意義】增高見(jiàn)于原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)、慢性。腎功能不全、畸形性骨炎、骨轉(zhuǎn)移癌、卵巢切除術(shù)后、高轉(zhuǎn)換率的骨質(zhì)疏松患者。降低見(jiàn)于骨吸收降低的疾病，如甲狀旁腺功能降低。老年性骨質(zhì)疏松癥患者TRAP增高不顯著。
【方法評(píng)價(jià)】
(1)酶動(dòng)力學(xué)法：靈敏度為0.1u/L，精
密度：批內(nèi)變異CV<6.5%，批問(wèn)變異CV<8％。
(2)酶聯(lián)免疫法：純化的TRAP抗體不能完全識(shí)別骨性TRAP，因此敏感性受影響。結(jié)果在參考值范圍之內(nèi)，不能完全排除骨代謝沒(méi)有異常，因此，所有結(jié)果應(yīng)該結(jié)合臨床數(shù)據(jù)和其他診斷指標(biāo)來(lái)解釋。檢測(cè)靈敏度為0.5～10U/L，精
密度：批內(nèi)CV為6.0％，批問(wèn)CV為9.2％，回收率為100.9%，高濃度脂血有可能降低吸光度，干擾檢測(cè)結(jié)果。
4．尿HOP常用的有氯胺T化學(xué)法、離子交換色譜法和反相高效液相色譜法等。一般采用氯胺T化學(xué)法。
【檢測(cè)方法】氯胺T化學(xué)法：尿中與肽結(jié)合的羥脯氨酸，經(jīng)酸水解后釋出。用氯胺T(N-氯-對(duì)甲基苯磺酰胺鈉)將羥脯氨酸氧化，使其形成含吡咯環(huán)的氧化物。再用過(guò)氯酸破壞多余的氯胺T，終止氧化過(guò)程。同時(shí)，使氧化物與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)，生成紅色化合物進(jìn)行比色定量。一般檢測(cè)空腹晨尿、空腹2小時(shí)尿HOP，及與Cr的比值、24小時(shí)尿：HOP等。
【參考區(qū)間】清晨第二次空腹尿，尿羥脯氨酸與肌酐的比值(HOP/Cr)的參考區(qū)間為0.06～0.016。24小時(shí)尿HOP測(cè)定的參考區(qū)間為114～300μmol/24h。
【臨床意義】增加見(jiàn)于各種骨代謝性疾病，如Paget病、骨軟化癥，骨腫瘤等。嚴(yán)重骨折患者尿中也可增加。兒童生長(zhǎng)期、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、甲狀腺功能亢進(jìn)、骨轉(zhuǎn)移癌、慢性腎功能不全、畸形性骨炎、高轉(zhuǎn)換的骨質(zhì)疏松癥患者、佝僂病和軟骨病，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥等HOP升高。降低見(jiàn)于甲狀腺功能低下、侏儒癥等。老年性骨質(zhì)疏松癥HOP的變化不顯著。
【方法評(píng)價(jià)】此法不特異，受飲食影響較大，收集24小時(shí)尿之前，應(yīng)素食2～3天。
參考資料：骨代謝異常的生物化學(xué)檢驗(yàn)
